ベネチンで治療したカンジダ・アルビカンス細胞の異常な変化

Scientific Reports volume 13、記事番号: 2844 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

本研究では、Dendrobaena veneta ミミズの体腔液から得られたタンパク質多糖複合体 Venetin-1 のカンジダ アルビカンス細胞に対する効果を特徴付けました。 この化合物は、以前の研究で実証されていたように、ヒトの皮膚線維芽細胞に対して細胞毒性を示さずに真菌細胞を破壊した。 この複合体は真菌の細胞壁と膜に影響を与えるため、既知の抗真菌性抗生物質フルコナゾールと比較されました。 どちらの調製物も酵母細胞の分裂を妨害し、未分離の細胞の凝集体および鎖の形成をもたらしました。これは蛍光色素による染色によって示されました。 Calcofluor ホワイトによる細胞壁の蛍光染色により、両方の物質の作用後に形成される凝集体の種類の比較が容易になりました。 コンゴーレッドを使用して行われた分析では、ベネチン-1 が細胞壁のより深い層を露出させたのに対し、フルコナゾールの使用後にはそのような効果は見られなかったことが示されました。 FTIR 分析により、Venetin-1 複合体の適用後の細胞壁のマンノタンパク質層の変化が確認されました。 ローダミン 123 による染色とフローサイトメトリーの使用により、ミトコンドリアの変化を比較することができました。 著しく伸長したミトコンドリアは、Venetin-1 の適用後に観察されましたが、古典的な抗生物質の適用後では観察されませんでした。 位相差顕微鏡検査により、Venetin-1 適用後の液胞の拡大が明らかになりました。 ベネチン-1およびフルコナゾールで処理したカンジダ・アルビカンス細胞のフローサイトメトリー分析では、両方の物質が細胞生存率の大幅な低下を引き起こすことが示されました。

近年、外科手術と慢性疾患や感染症の治療の両面で医療の進歩が著しく加速しています。 したがって、外科的治療、抗生物質療法、化学療法、または病院の集中治療室 (ICU) での治療の結果として免疫力が低下した患者の数が増加しています1、2、3、4。 この状況の暗い側面は、院内感染の増加です。 これらは、とりわけ抗生物質の過剰使用によって引き起こされ、一般的に使用される薬剤に対する微生物耐性の発現につながります5。 院内病原体による感染は、患者の医療施設での滞在期間を延長し、治療費を増加させます2、3、6。

カンジダ菌、特にカンジダ・アルビカンスは、そのような感染症を引き起こす病原体の例である。 C. albicans は、健康な被験者の皮膚および粘膜の表面に腸内細菌叢の一部として共生する日和見病原体です 7、8、9。 免疫不全患者では、この真菌は皮膚や粘膜の感染症、さらには生命を脅かす全身性カンジダ症や全身感染症を引き起こします7、10、11。 この酵母は、米国では 4 番目に一般的な ICU 病原体であり、ヨーロッパでは最初のものです 3,4。 ICU 入室に伴うカンジダ血液感染症は症例の約 40% を占め、患者の 9.3% が敗血症を発症します2。

C. albicans が病原体として成功したのは、ゲノムの高い可塑性、バイオフィルムを生成する能力、溶解酵素の生成、および表面に付着する能力によるものです 7、9、11、12、13。 バイオフィルムは患者にとって特に危険です。 それらは自然表面と人工表面の両方に形成できます。 バイオフィルムは高濃度の抗真菌性抗生物質に対して耐性があるため、除去が困難であり、体内に新たな感染巣を作り出す可能性がある病原性細胞の供給源となります7、14、15。 カンジダに感染した被験者の死亡率は 40% にも達すると推定されています 2,3,16,17。

フルコナゾールは、カンジダ症の治療に最も一般的に使用される抗生物質の 1 つです。 これは、膜ステロールの合成に関与する酵素 14-α-ステロール デメチラーゼを阻害することによって作用するアゾール系抗生物質です7。 これにより細胞膜の性質と構造が変化し、真菌の増殖が阻害されます。 フルコナゾールは宿主細胞に対する毒性が低いにもかかわらず、この薬剤はカンジダ症の治療には効果がないと報告されることが増えています7。 これは、微生物の遺伝物質の突然変異による抗生物質耐性の発現によって引き起こされ、細胞表面の多剤ポンプの数が増加します7,18。

C. albicans は抗生物質耐性を発現する傾向があるため、カンジダ症の治療に使用できる代替製剤を探す必要があります。 何百年にもわたって自然医学にインスピレーションを与えてきた自然環境は、そのような物質の供給源として使用できます。 ミミズは、伝統的な極東医学において真菌感染症の治療に長い間使用されてきた生物です。 また、黄疸や心血管疾患などの他の多くの病気の治療や免疫力の向上にも使用されています19,20。 ミミズとその共生生物から調製されたペースト、粉末、抽出物は、カンジダ酵母および細菌に対する活性を記録しています20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31。 ミミズの体腔液、体腔液から分離された画分、およびこれらの無脊椎動物からの抽出物は、抗凝固作用、抗炎症作用、および抗腫瘍作用も示します 19,32,33。

私たちの研究は、体腔液からの画分として以前に説明されたタンパク質-多糖複合体が、正常なヒト線維芽細胞に対して細胞傷害活性を持たないことを示しました34。 ベネチン-1複合体は、非小肺がん35および結腸がん36に対して抗腫瘍活性を示し、凝固障害や細胞毒性を伴わずに多経路の抗血小板効果を発揮しました37。 活性化合物は、高温でのインキュベーションを使用して細胞毒性を除去した後、ミミズの体腔液から分離されました 33。 このプロセスの後、抗腫瘍および抗真菌活性は維持され、同時に正常細胞も残されました。 化学の観点からは、調製物は各分析点で同じ組成を有しており、以前の出版物ではタンパク質多糖化合物および寸法 58.23 ± 3.93 nm の微粒子として化学的に特徴付けられていました 34,35。

以前の出版物で示されているように、得られた複合体は C. albicans の細胞壁と膜に作用するため、やはり真菌の細胞膜と相互作用する標準的な抗生物質と比較してこの効果を分析することが賢明であると考えられました。 微生物の抗生物質耐性の増加を考慮すると、複合体の抗真菌活性に関する研究結果は、体腔液からの複合体がカンジダ属の真菌によって引き起こされる病気と戦うための貴重な製剤である可能性を示唆しています。

この研究では Dendrabaena veneta ミミズを使用しました。 これらの無脊椎動物は、ルブリン（ポーランド）にあるマリア・キュリー・スクウォドフスカ大学の免疫生物学部門で監視された条件下で飼育されました。 環形動物は3Lの容量の容器に保管されました。 コンテナを堆肥土壌で満たし、25 °C、湿度 70 ～ 80% で空気を流しながら暗所に保管しました。 ミミズには週に3回、緑茶の葉、セルロース、茹でた野菜を与えた。 実験には成熟したミミズのみを選択しました。

水ですすいだミミズを湿ったリグニン上で 24 時間保管しました。 体腔液 (CF) は、導電性を維持するために少量の 0.9% NaCl に浸した 10 人のグループから得られました。 流体は、4.5 V の電流を 1 分間印加して電気刺激した後に得られました。 得られたＣＦを遠心分離（６０００×ｇ、１０分間）して体腔細胞を分離した。 次に、上清を 0.22 Millipore フィルターで濾過し、70 °C で 10 分間加熱しました。 次に、無細胞 CF を 12 ～ 14 kDa カットオフの透析バッグに移し、蒸留水に対して 4 °C で一晩透析しました。 無菌複合体をエッペンドルフチューブに移し、凍結乾燥し、-20 °C で保存しました。 Venetin-1 複合体中のタンパク質濃度は、Bradford 法で測定されました 38。

微生物学的分析に使用された C. albicans 野生型株の臨床分離株は、グダニスク医科大学口腔微生物学科の A. Kędzia 教授から寄贈されました。 実験の前に、菌類培養物を液体サブロー培地中で 28 °C で事前に増殖させました。 24 時間のインキュベーション後、C. albicans 培養物 (対数増殖期で 107 CFU) 30 μL を、硫酸ストレプトマイシン (Sigma) を最終濃度 0.17 mg mL-1 で補充した YPD 貧培地 150 μL に添加しました。ベネチン-1またはフルコナゾール。 実験で使用したベネチン-1とフルコナゾールの最終濃度は、それぞれ25、50、および100μg mL-1、および5、10、および20μg mL-1でした。 サンプルを振とうしながら 37 °C で 48 時間インキュベートしました。

顕微鏡分析を目的とした細胞培養物は、材料と方法の「ベネチン-1 およびフルコナゾールを使用した C. アルビカンス細胞培養物の調製」セクションに記載されているように調製しました。 位相差光学顕微鏡分析は、未染色のカンジダ・アルビカンス細胞を使用して実施した。 4 つの蛍光色素:コンゴレッド、カルコフルオールホワイト、ヨウ化プロピジウム混合物を含むヘキスト 33342、およびローダミン 123 を蛍光顕微鏡に使用しました。 蛍光顕微鏡分析および位相コントラスト分析は、共焦点レーザー走査型顕微鏡（Carl Zeiss、イエナ、ドイツ）を使用して実施した。 解析に使用したすべての励起波長と可視化された構造を表 1 に示します。

カルコフルオール ホワイト (Fluka) は、真菌の細胞壁のキチンに結合します。 蛍光色素 (20% 水溶液) を、分析した細胞の 1:1 懸濁液と室温、暗所で 10 分間インキュベートしました。 次に、懸濁液 2 μL を顕微鏡スライド上に移し、観察しました。 1000 個の形態を分析した後、すべての培養物に存在する凝集体をカウントしました。 実験は３回繰り返された。 同定された形態は、単一細胞、二重細胞、三重細胞、四つ細胞、鎖、小さな凝集体 (< 10 細胞)、大きな凝集体 (> 10 細胞)、および菌糸/偽菌糸でした。

コンゴーレッド色素 (Sigma-Aldrich) を使用して、細胞壁の β-1,4 グルカン 1,- を視覚化しました。 色素の水溶液 (2%) を、分析した C. アルビカンス細胞の懸濁液と 1:1 の比率で混合しました。 暗所、室温で 3 分間インキュベートした後、2 μL の調製物をスライド上に移し、観察しました。

Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) とヨウ化プロピジウム (Sigma-Aldrich) の染色混合物を調製し、真菌培養物に 1:1 の比率で添加し、暗所で 37 °C で 5 分間インキュベートしました。 2 μL の細胞懸濁液を顕微鏡下で分析しました。 色素は、現在の状態の細胞の遺伝物質を視覚化するために使用されました。通常の細胞は核の青色蛍光を示し、アポトーシス細胞は断片化された遺伝物質の明るい白色蛍光を示し、壊死細胞は赤色蛍光を示しました39,40。

ローダミン 123 (ThermoFisher Scientific) 色素は、適切に機能しているミトコンドリアの膜を染色するために使用されます。 活性ミトコンドリアは緑色の蛍光を示します。 ミトコンドリアの機能が障害された細胞は膜電位を持たず、蛍光を発しません。 ローダミン 123 は 2 つの濃度で使用されました。コントロール細胞およびベネチン-1 でインキュベートした培養物には 120 μg mL-1、フルコナゾールで処理した細胞には 30 μg mL-1 でした。 フルコナゾールに対する低用量の色素の使用は、抗生物質処理後のカンジダ・アルビカンス細胞壁の透過性の増加に関連していた。 ネガティブコントロールは、ミトコンドリア呼吸経路の阻害剤であるアジ化ナトリウムを使用して実施されました41。 1.3% アジ化ナトリウム (Sigma) 溶液を対照細胞と 1:1 の比率で室温で 10 分間インキュベートしました。 すべての真菌細胞、すなわち陰性および陽性対照、およびフルコナゾールおよびベネチン-1で処理した細胞を、さまざまな濃度のローダミン123とともに37℃で20分間インキュベートし、滅菌水で3回洗浄しました。 サンプルを顕微鏡スライドに移し、観察しました。

対照培養細胞および100μg mL-1の濃度のVenetin-1で処理した細胞を遠心分離し(室温、6000×g、10分間)、上清を廃棄した。 ペレットを２００μＬのＧＨ溶液（グルコース、ＨＥＰＥＳ、滅菌水から構成される）に懸濁し、再度遠心分離した。 その後、上清を除去し、GH溶液を20μL添加した。 次に、細胞を温度-92℃の昇華チャンバーに12分間移しました。 その後、凍結培養物を準備チャンバー内で切断し、ZEISS Ultra Plus 電界放出顕微鏡 (Carl Zeiss、ドイツ) を用いて、高電子張力 (EHT) 5 kV、倍率 30,000 × 39,42 で分析しました。

材料と方法の「ベネチン-1およびフルコナゾールを用いたC.アルビカンス細胞培養物の調製」セクションに記載されているように調製した細胞培養物を、室温、2500×gで10分間遠心分離した。 上清を捨て、ペレットを70μLの固定液(10mlリン酸緩衝液pH=7、10mlグルタルアルデヒド10%、200mgサッカロース)に懸濁し、室温で2時間インキュベートした。 次に、固定溶液を廃棄し、0.1 M リン酸緩衝液 (pH = 7) を添加しました。 遠心分離(2500×g、30分間、室温)後、1.5% OsO4溶液を添加し、細胞とともに室温で30分間インキュベートした。 その後、菌体を遠心分離し、上清を除去した。 次に、培養物をリン酸緩衝液で洗浄し、遠心分離した。 このようにして調製した細胞を一連のアセトン希釈液 (15%、30%、50%、70%、100%) で脱水し、カーボンディスクを備えた SEM ステージに移し、デシケーター内で 24 時間乾燥させました。ローストシリコーンゲル（180℃で2時間）。 その後、K550X スパッタリング装置 (Quorum Technologies、英国) を使用して、プローブを備えたステージを金層でコーティングし、走査型電子顕微鏡 Tescan Vega 3 (Tescan Orsay Holding、チェコ共和国) を使用して観察しました39。

私たちの研究で使用されたフローサイトメトリー分析により、生細胞、アポトーシス細胞、死細胞を区別することができました。 材料および方法の「ベネチン-1およびフルコナゾールを用いたC.アルビカンス細胞培養物の調製」セクションに記載されているように、細胞培養物を分析用に調製した。 次に、細胞培養懸濁液 20 μL を ViaCount 試薬 (Luminex、米国) 780 μL に加え、暗所、室温で 5 分間インキュベートしました。 ViaCount に使用される発光記録チャンネルは赤と黄色でした。 各サンプルについて 5000 個の細胞をカウントしました。 結果は、Via カウント指定を使用して GuavaSoft ソフトウェアで分析され、EasyFit ツールで生存率がカウントされました。これにより、互いに重なり合う生存細胞とアポトーシス細胞を区別できます。 フローサイトメトリー分析は、Guava easyCyte フローサイトメーター (Luminex、米国) を使用して実行されました。

C. albicans 細胞内の活性ミトコンドリアのフローサイトメトリー分析は、ローダミン 123 (水溶液 20 μg mL-1) を使用して実行されました。 材料と方法の「ベネチン-1 およびフルコナゾールを用いた C. albicanss 細胞培養物の調製」セクションに記載されているように調製した細胞懸濁液を蛍光色素溶液と混合し、暗所、室温で 10 分間インキュベートしました 41。 放射記録に使用されたチャネルは、前方散乱光とグリーンでした。 結果は、InCyte プログラムを使用して分析されました。 統計的有意性分析は、Statistica プログラムと HSD Tuckey テストを使用して実行されました。

FTIR 分光法は、有機および無機化合物の化学構造の観察を可能にする最も頻繁に使用される研究手法の 1 つです。 生物学的システムの研究でも広く使用されています。 他の分光法と比較した FTIR 技術の主な利点は、ほとんどすべての化合物が IR スペクトル領域で放射線の特徴的な吸収を示すという事実です。 したがって、定性的および定量的の両方で分析できます43。 赤外分光法は、分子の振動レベルの励起に関連する放射線の吸収を調べます。これにより、化学結合領域の変化の観察が容易になります。 濃度 100 μg mL-1 の Venetin-1 および濃度 20 μg mL-1 のフルコナゾールで処理した後に C. albicans 細胞に起こる変化を観察するために、調製したサンプルの FTIR スペクトルを取得しました。 。 試験は、ATR 技術を使用して室温でサンプル表面から直接実行されました。 分光計は、DTGS (重水素化硫酸トリグリシン) 検出器を備えた Smart Orbit™ ダイヤモンド ATR アタッチメントを備えた Thermo Nicolet 8700 FTIR 分光計を使用して記録されました。 スペクトルは、中赤外範囲：4000〜650 cm-1、スペクトル分解能 4 cm-1 で記録されました。 得られたスペクトルには、ベースライン補正とスケール正規化が施されました。

細胞壁の強い発光をもたらす Calcofluor 白色染色により、C. albicans 細胞の培養物中のさまざまな凝集体が区別されました (図 1)。 C. アルビカンス細胞を、さまざまな濃度のベネチン-1 およびフルコナゾールとともにインキュベートしました。 その後、個々の凝集体を計数し、そのパーセンテージを図 2 に示します。単一細胞の数は、対照培養液の 43.72% から、100 μg mL-1 の濃度の Venetin-1 とインキュベートした培養液では 17.61% に減少しました。 10 μg mL-1の濃度のフルコナゾールで処理した培養物では10.79%まで。 フルコナゾール(5μg mL-1の濃度)とともにインキュベートした培養物では、対照培養物と比較して2倍の真菌トリプレット(すなわち、それぞれ8.96%および4.70%)が観察された。 また、ベネチン-1 とフルコナゾールの両方とともにインキュベートした培養物では、形成される四つ子も少なくなりました。 小さな凝集体（10 個未満の細胞で構成される）の割合は、対照培養物と、ベネチン-1 およびフルコナゾールで処理した培養物との間で差異がありませんでした。 大きな凝集体（10 個以上の細胞を含む）の形成は、対照培養液の 4.7% から、100 μg mL-1 の濃度の Venetin-1 とインキュベートした培養液の 18.24% へと有意な増加が観察されました。 フルコナゾール (20 μg mL-1) とインキュベートした細胞培養で形成された鎖の割合も、対照培養と比較して変化しました (1.34 から 17.14%)。 菌糸/偽菌糸数の有意な増加も両方の調製物とのインキュベーション後に観察され、対照培養物では 4.7%、ベネチン-1 (100 μg mL-1) とインキュベートした培養物では 30.19%、添加後では 22.86% に達しました。フルコナゾール (20 μg mL-1) とのインキュベーション (図 1)。

Calcofluor ホワイトで染色した後の C. アルビカンス細胞の凝集体の画像：（A1）-（A2）- コントロールの C. アルビカンス細胞。 (B) - 100 μg mL-1のベネチン-1で処理した後のC. albicans 細胞。 (C) - 20 μg mL-1のフルコナゾールとインキュベートした後のカンジダ・アルビカンス細胞。 スケールバーは 5 μm を表します。

対照カンジダ・アルビカンス培養物および異なる濃度のベネチン-1およびフルコナゾールとともにインキュベートした培養物における凝集体の種類。 上部のパネルに表示される色は、円グラフの色に対応します。 スケールバーは 2 μm を表します。

対照のコンゴレッド染色は、細胞が円形または楕円形であり、細胞壁がわずかに赤い蛍光を発していることを示した（図３１Ａ）。 25μg mL-1の濃度のベネチン-1とインキュベートした後に観察された細胞はより大きく、より強い蛍光を発していた(図31B)。 写真ICは、50μg mL-1のベネチン-1で処理した後の細胞形状の変化およびサイズの増加を示しています（図3IC）。 100 μg mL-1のVenetin-1とインキュベートした後、非分離細胞および赤色蛍光が細胞表面全体で観察されました（図3ID）。 5 μg mL-1 および 10 μg mL-1 の濃度のフルコナゾールで処理した培養物では、細胞の形状とサイズ、および非分離細胞の分枝鎖に変化が見られ、対照培養物よりも明るい蛍光が示されました（図 3IE）。 -F）。 20μg mL-1のフルコナゾールとともにインキュベートした培養物は、鎖形成細胞間にさらに蛍光結合を有した(図31G)。 さらに、このサンプルでは偽菌糸と芽痕のある細胞が見られました。 すべてのフルコナゾール濃度でのインキュベーションでは、Venetin-1 の使用後に観察されたものと比較して、より強い蛍光は発生しませんでした。

ベネチン-1およびフルコナゾールとインキュベートした後のICアルビカンス細胞をコンゴレッド色素で染色: (A) - 対照培養の細胞。 (B) - 25 μg mL-1 の Venetin-1 とインキュベートした後の細胞。 (C) - 50 μg mL-1 のベネチン-1 を含む。 (D) - 100 μg mL-1 のベネチン-1 を含む。 (E) - 5 μg mL-1のフルコナゾールとインキュベートした後の細胞。 (F) - フルコナゾール 10 μg mL-1 を含む。 (G) - 20 μg mL-1 のフルコナゾールを含む。 スケールバーは 10 μm を表します。 II. C. albicans 細胞の低温 SEM 画像。 A – A1 – 対照培養の細胞、B – B1 – 100 µg mL-1 の Venetin-1 とインキュベートした後の細胞。 スケールバーは 1 μm を表します。

Cryo-SEM 技術を使用して細胞壁表面を視覚化しました。 図３ＩＩＡ、Ａ１の画像は、対照培養物におけるカンジダ・アルビカンスの細胞壁の表面を示す。 表面は明らかにゴツゴツしていました。 最高濃度 (100 μg mL-1) での Venetin-1 の使用には壁面平滑化効果があり、これは菌壁の構造の乱れを示している可能性があります (図 3 II B、B1)。

Hoechst 33342 とヨウ化プロピジウムの混合物を使用すると、正常細胞、アポトーシス細胞、壊死細胞の区別が容易になりました。 正常な細胞核は青色の蛍光を示し、規則的な形状をしていました。 アポトーシス細胞は明るい白青の蛍光を発する断片化した遺伝物質を持っていましたが、壊死細胞は核物質の赤色によって特徴づけられました。

対照の C. albicans 細胞は、青色の蛍光を発する楕円形の核を持っていました (図 4 I A1 ～ A3 および II A1 ～ A3)。 50 μg mL-1 の濃度のベネチン-1 で処理した細胞には、2 つの細胞、つまり親細胞と娘細胞の接合部に遺伝物質が分布しており、細胞分裂プロセスの障害が示唆されています (図 4 I B1 ～ B3、マーク付き)黄色の矢印付き）。 100 μg mL-1 の Venetin-1 とインキュベートした後の細胞は、図 4 I C1-C3 の白い矢印で示すように、細胞間の分離が不完全でした。 核が断片化したアポトーシス細胞は図 4I C1-C2 に示されており、オレンジ色の矢印で示されています。

ベネチン-1およびフルコナゾールとインキュベートした後のC.アルビカンス細胞を、ヘキスト33342およびヨウ化プロピジウム色素の混合物で染色した。 I- A1 ～ A3 - 対照培養細胞。 B1–B3 - 50 μg mL-1 の Venetin-1 とインキュベートした後の細胞。 C1～C3 - ベネチン-1 100 μg mL-1 を含む。 II- A1 ～ A3 - 対照培養細胞、B1 ～ B3 - 10 μg mL-1 のフルコナゾールとインキュベートした後の細胞、C1 ～ C3 - 20 μg mL-1 のフルコナゾールとインキュベートした後の細胞。 黄色の矢印は、細胞分裂後の細胞の分離されていない遺伝物質を示します。 白い矢印は、分裂後の細胞の分離が不完全であることを示します。 オレンジ色の矢印はアポトーシス細胞を示します。 スケールバーは 5 μm を表します。

フルコナゾールで処理した後の細胞も、10 μg mL-1 (図 4 II B1-B3) と 20 μg mL-1 (図 4) の両方で白い矢印で示されているように、鎖の形成を引き起こす不完全な分離を示しました。 II C1–C3)。 図 4 II B2 のオレンジ色の矢印は、アポトーシス細胞の核を示します。

提示された画像は、ベネチン-1 とフルコナゾールの両方の適用後の細胞分裂の乱れの影響を示しています。 しかし、細胞分裂中の核物質の分離における障害は、Venetin-1 の適用後にのみ観察されました。 フルコナゾールの適用後、細胞は鎖を形成しましたが、細胞間の狭窄には遺伝物質は観察されませんでした。 これらの観察は、同様の顕微鏡観察にもかかわらず、両方の製剤の作用機序が異なることを示しています。

出芽過程にある C. albicans 細胞も SEM および Cryo SEM 顕微鏡技術によって分析されました (図 5)。 対照培養細胞の断面図を図5Aの画像に示します。 適切な出芽が見られ、遺伝物質が親細胞と娘細胞の間で完全に分離されています (四角でマークされた領域)。 100 μg mL-1のVenetin-1とのインキュベーションに供された細胞は、図5Bの画像で視覚化されています。 この写真は、親細胞と娘細胞 (白枠でマーク) の間で不完全に分離された遺伝物質を示しており、図 4I に示す画像に対応します。 対照培養物の SEM 画像は、はっきりと見える分裂リングを伴う正常な細胞分裂を示しています (図 5C)。 図 5D の画像は、細胞分離が不完全な 100 μg mL-1 のベネチン-1 で処理した後の酵母細胞を示しています。 SEM 画像は Cryo-SEM 法で得られた画像と一致しています。

Cryo-SEM (A、B) および SEM (C、D) によって画像化された C. アルビカンス細胞: (A) - 対照培養からの出芽 C. アルビカンス細胞の断面図。 (B) - 100 μg mL-1のベネチン-1とインキュベートした後の出芽カンジダ・アルビカンス細胞の断面図。 (C) - 対照培養物からのカンジダ・アルビカンスの細胞。 (D) - 100 μg mL-1 の Venetin-1 とインキュベートした後の細胞。 スケールバーは 2 μm を表します。

ローダミン 123 色素を使用して実行された分析では、対照細胞のミトコンドリアが細胞の内周に位置する小さな緑色の点として視覚化されました (図 6A)。 アジ化ナトリウムとともにインキュベートしたネガティブコントロールの細胞は、観察可能な蛍光を発しませんでした（図６Ｂ１）。 図 6 の画像 B2 は、透過光顕微鏡からの画像 B1 に相当します。 25 μg mL-1 の Venetin-1 とインキュベートした後、伸長したミトコンドリアを有する細胞 (図 6C1-C2、白い矢印でマーク) と正常なミトコンドリアを有する細胞 (図 6C1-C2、黄色の矢印でマーク) が観察されました。 50 μg mL-1 の量の Venetin-1 を適用した後、ミトコンドリアは細胞内腔を満たす長く折り畳まれた緑色の発光構造として視覚化されることがよくありました (図 6D1-D2)。 100 μg mL-1のベネチン-1の作用を受けた培養物はさらに内部蛍光のない細胞を示し、これはそれらのミトコンドリアが不活性であることを示唆しています（図6E1-E2、赤い矢印でマーク）。 伸長したミトコンドリアを持つ細胞は、同じ画像内で白い矢印でマークされています。 フルコナゾールとのインキュベーションは、ミトコンドリアのサイズや局在に重大な変化を引き起こしませんでした（図6F-H）。 一部の細胞は、フルコナゾール処理後の細胞膜の透過性の増加によって引き起こされる蛍光色素の高い取り込みにより、強い緑色蛍光を示しました。

C. albicans 細胞のローダミン 123 染色。 (A) - 小さな丸いミトコンドリアを持つポジティブコントロール細胞。 (B1) – (B2) - アジ化ナトリウムで処理したネガティブコントロール細胞。 写真 (B2) は透過光顕微鏡で細胞を視覚化したもので、蛍光顕微鏡での写真 (B1) と同等です。 (C1) – (C2) – C. 25 μg mL-1のベネチン-1で処理したアルビカンス細胞、(D1)-(D2)-50 μg mL-1のベネチン-1で処理、(E1)-(E2)-100 μg mL-1のベネチン-1で処理1; (F)-C. 5 μg mL-1のフルコナゾールで処理したアルビカンス細胞、(G) - 10 μg mL-1のフルコナゾールで処理、(H) - 20 μg mL-1のフルコナゾールで処理。 黄色の矢印は、正常な形状のミトコンドリアを持つ細胞を示しています。 白い矢印は、細長いミトコンドリアを持つ細胞を示します。 赤い矢印は、ミトコンドリアが不活性であるために内部蛍光を発しない細胞を示します。 スケールバーは 10 μm を表します。

フローサイトメトリーを使用して、ローダミン 123 による活性ミトコンドリアを分析しました。結果を図 7a に示します。 上のドット プロットは、ゲート領域における培養間の差異を示しています。R1 - 通常の細胞、R2 - 凝集体、R3 - 活性なミトコンドリアを持つ細胞。 R1に含まれないR3領域では、細胞のミトコンドリアに異常が生じます。 すべての培養物中の活性細胞 (ゲート R3) の割合は同様でした。対照培養物では 60.9%、ベネチン-1 (100 μg mL-1) でのインキュベーション後では 64.34%、フルコナゾール (100 μg mL-1) での処理では 66.22% でした。 20 μg mL−1)。 対照培養細胞（52.7%）およびフルコナゾールで処理した細胞（57.64%）と比較して、Venetin-1 で処理した後の通常の細胞（36.1%）の数に有意差が認められました。 R2 ゲートの変化も明確に見られ、対照培養では 6.38%、Venetin-1 で処理した細胞では 8.42%、フルコナゾールでインキュベートした培養では 0.22% でした。

(a) ローダミン 123 を使用した活性ミトコンドリアのフローサイトメトリー分析。対照培養のドットプロット。100 μg mL-1 のベネチン-1 で処理した後の細胞、および 20 μg mL-1 のフルコナゾールで処理したバリアントの細胞。 R1 - 規則的なミトコンドリアを持つ細胞。 R2- 凝集体。 R3- 活性なミトコンドリアを持つ細胞。 (b) フローサイトメトリー分析後のゲート領域: 通常のミトコンドリアを持つ R1 細胞。 R2- 凝集体。 R3- 活性なミトコンドリアを持つ細胞。 ヒストグラムは、ゲート領域の細胞培養のプロファイルを示します。 緑色 - 対照サンプル、赤色 - 100 μg mL-1のベネチン-1で処理後の細胞、紫色 - 20 μg mL-1のフルコナゾールに処理した細胞。

側方散乱は、ミトコンドリアを含む細胞の複雑さまたは粒度に関連します。 ヒストグラム (図 7b) は、ベネチン-1 とインキュベートした細胞培養におけるさまざまなプロファイルを示しており、この製剤での処理後にミトコンドリアの構造が変化したことを示しています。 観察では、対照真菌培養物と比較して、フルコナゾール処理後のミトコンドリア形態の変化は示されませんでした。

位相差顕微鏡法は、細胞液胞など、自然なコントラストを示さない対象物の観察に有用な方法です。 コントロールの C. albicans 細胞の顕微鏡画像から、正しい楕円形の細胞が明らかになりました (図 8A1-A2)。 25、50、および100 μg mL-1の濃度でベネチン-1複合体に曝露された細胞は、胚盤胞子細胞と菌糸細胞の両方で観察される液胞の拡大によって特徴付けられました（図8B1-B2、C1-C2、D1-D2、変化した液胞は矢印で示されています）。 さらに、変化した液胞はより多く、処理された細胞の大部分を満たしていました（図8B2、D1-D2）。 次に、フルコナゾールは、使用したどの濃度（5、10、20 μg mL-1）でも C. albicans 細胞に肥大した液胞の形成を引き起こさなかったが、多くの粒度を持ち、サイズが著しく拡大した細胞が存在した。コントロールセル（図8E1〜E2、F1〜F2、G1〜G2）。

C. albicans 細胞の位相差顕微鏡検査。 (A1) – (A2) – C. アルビカンス制御細胞。 (B1) – (B2) – C. 25 μg mL-1のベネチン-1とインキュベートした後のアルビカンス。 (C1)-(C2) - 50 μg mL-1 のベネチン-1 を含む。 (D1)-(D2) - 100 μg mL-1 のベネチン-1 を使用。 (E1) – (E2) – C. 5 μg mL-1のフルコナゾールとインキュベートした後のアルビカンス。 (F1)-(F2) - 10 μg mL-1 のフルコナゾールを使用。 (G1)–(G2)—20 µg mL-1 のフルコナゾールを使用。 矢印は、Venetin-1 複合体の作用後の C. albicans 細胞の拡大した液胞を示します。 スケールバーは5μmに相当します。

フローサイトメトリー技術を使用して、ベネチン-1 およびフルコナゾールで処理した細胞の生存率を分析しました (図 9)。 対照培養細胞のフローサイトメトリー画像を写真１Ａに示す。 生存率は 76.68% と推定されました。 図9B1〜B3の画像は、最終濃度25μg mL-1（図9a B1）、50μg mL-1（図9a B2）のベネチン-1とともにインキュベートした細胞培養物の分析から得られたデータを示しています。 、および 100 μg mL−1 (図 9a B3)。 アポトーシス細胞の割合は、25 μg mL-1 のベネチン-1 で処理後の 17.18% (図 9a B1)、50 μg mL-1 で 56.91% (図 9a B2)、100 μg mL で 50.78% でした。 −1 (図 9a B3)。 図 9a B3 の画像は、死んだ細胞の別のグループを示しています。 図9aのC1〜C2、およびC3のドットプロットは、5、10、および20μg mL-1の濃度でフルコナゾールでインキュベートした細胞の分析後に得られたデータを示しています。 アポトーシス細胞の割合はフルコナゾール濃度の増加とともに増加し、フルコナゾール 5 μg mL-1 でインキュベートした細胞培養では 22.11%、10 μg mL-1 で 26.88%、20 μg mL-1 で 58.41% に達しました。 図９ｂは、異なる濃度のベネチン－１およびフルコナゾールに曝露された培養物中の対照細胞の総数を示す。 処理した細胞と未処理の細胞の間には有意な差がありました。

(a) C. albicans 細胞培養のフローサイトメトリー データ: (A) - 対照細胞培養。 (B1) - 25 μg mL-1のベネチン-1で処理した細胞培養物、(B2) - 50 μg mL-1のベネチン-1で処理した細胞培養物、(B3) - 100 μg mL-1のベネチン-1で処理した細胞培養。 (C1) - 5 μg mL-1のフルコナゾールで処理した細胞培養物。 (C2) - フルコナゾール 10 μg mL-1 を使用、(C3) - フルコナゾール 20 μg mL-1 を使用。 赤色は生細胞に対応し、黒色はアポトーシス細胞を示します。 (b) 培養物中の細胞の総数。 コントロール - コントロールのカンジダ・アルビカンス細胞。 V25、V50、V100—C。 25、50、100 μg mL-1のベネチン-1で処理したアルビカンス細胞。 FL5、FL10、FL20 - 5、10、20 μg mL-1のフルコナゾールで処理した細胞。 *** P < 0.01 (HSD Tukey テスト)。

FTIRスペクトルでは、3200〜2800cm-1、1720〜1400cm-1、1200〜950cm-1の範囲の3つのスペクトル領域が分析されました（図10）。 脂質内で生じる結合に対応する振動に特徴的な信号が、FTIR スペクトルの 3200 ～ 2800 cm-1 の範囲で観察されました。 1720〜1400 cm-1の範囲ではタンパク質に生じる結合に特徴的な振動に対応するピークが示され、1200〜950 cm-1の範囲では多糖類に特徴的なバンドが観察されました。 試験では、C. albicans サンプルを 100 μg mL-1 の Venetin-1 で処理した後、2800 ～ 3500 cm-1 の領域でシグナルの増加が示されました (図 10)。 900 ～ 1800 cm-1 での信号の大幅な低下も観察されました。 フルコナゾール 20 μg mL-1 で C. albicans サンプルを処理した場合、1800 ～ 1200 cm-1 の範囲でのみシグナル強度の減少が観察されました。 文献データに基づいて、選択されたシグナルが特徴的な化学結合の割り当てとともに分析されました。 結果を表 2 に示します。

C. albicans 対照培養物 (対照)、および 100 μg mL-1 の Venetin-1 (V100) および 20 μg mL-1 (FL20) のフルコナゾールで処理した後の FTIR スペクトル。

初期の研究では、D. veneta の体腔液から得られた複合体が C. albicans の細胞壁と細胞膜に作用することが明らかになりました。 その効果は、その作用がよく知られているフルコナゾールの効果と比較されました。 フルコナゾールは、トリアゾール誘導体グループのアゾール系抗真菌薬です。 この合成化合物のグループに属する薬物の作用機序は、真菌の細胞膜を構築する成分の 1 つであるエルゴステロールの生合成を担う酵素の阻害に基づいています 10,45。 この代謝障害により、細胞膜の透過性が増加します。 細胞膜はその保護機能を失い、細胞は成長を停止し、その結果真菌は死滅します。

現在の薬や抗生物質は病原体に対する効果が薄れてきています。 これは、アゾールなどの一般的に使用される薬剤に対して真菌が抗生物質耐性を獲得しているという事実に関連しています46。 フルコナゾールは、抗真菌治療における第一選択薬です。 この抗生物質を長期間摂取したり、何度も治療したりすると、カンジダ耐性が生じる可能性があります47、48、49。 フルコナゾールは、集中治療室にいる患者、臓器移植患者、化学療法や放射線療法を受けている患者など、免疫不全患者の真菌症の予防に使用されます。 C. albicans の臨床分離株は、フルコナゾールに対して約 10 年間耐性を示すことが報告されています。 30 ～ 40%50,51。 C. albicans 感染患者に投与できる新しい抗真菌製剤の開発が急務であることがわかっています。

自然環境は常に、有益な特性を持つ物質を探すインスピレーションの源です。 細菌や菌類は抗生物質を生産し、エッセンシャルオイルやさまざまな有益な分子は植物から抽出できます45。 動物はまた、病気から身を守るために進化の過程で改良された物質を生成します。 地球上で最も長生きする動物の一つであるミミズもそのような生物です。

我々の以前の研究 34 では、ミミズの体腔液のタンパク質多糖類画分の作用後に Calcofluor 白色蛍光色素で染色された C. albicans 細胞について説明しました。 細胞壁が不均一に染色されることが観察され、これは活性剤で処理された酵母細胞の細胞壁のキチン層の厚さが異なることを示している。 本研究では、さまざまな細胞凝集体の形成も顕微鏡で画像化されました。 多細胞凝集体の種類と量は、複合体とのインキュベーション後とフルコナゾールとのインキュベーション後の両方で分析されました。 これらの分析では、多細胞形成の数の違いが示され、これはカンジダ・アルビカンスの細胞壁に対する異なる作用機序を示しています。 これは他の分析でも確認されました。

分析ではコンゴレッド蛍光色素を同時に使用しました。 (1,3)-β-グルカンと複合体を形成し、蛍光顕微鏡下で真菌の細胞壁の表面を赤色に蛍光させます。 Venetin-1 複合体は (1,3)-β-グルカンの露出を引き起こしましたが、フルコナゾールはこの細胞壁成分を露出させませんでした。 分割痕のみにわずかな蛍光が観察された。 これは、フルコナゾールで処理したカンジダ・アルビカンス細胞の壁に含まれるグルカンが大幅に少ないという、Pfaller と Riley52 によって記載された現象に関連している可能性があります。 多くの研究が、β-グルカン層を露出させるためのフルコナゾールとのさまざまな化合物の相乗作用を研究しています47、53、54、55。 私たちの場合、この露出は複合体の作用後にのみ観察され、Cryo-SEM によって確認されました。 Venetin-1 処理細胞の最外層の平坦化は、その下に β-グルカンの層が位置するマンノタンパク質層の破壊を示している可能性があり、コンゴレッド蛍光色素を使用した後に観察される赤色蛍光の説明になります。 真菌細胞壁のβ-グルカン成分の認識は、宿主免疫系の重要な要素です。 したがって、グルカンを露出する化合物は貴重な医薬品となる可能性があります53,56。

Venetin-1 の適用後に実施された C. albicans の FTIR 分光検査では、1720 ～ 1400 cm-1 および 1200 ～ 950 cm-1 の範囲でシグナル強度の減少が示されました。 これらのバンドは、カンジダ・アルビカンスの細胞壁の構成要素であるタンパク質や多糖類に見られる化学結合に特徴的な振動に対応しています。 タンパク質に特徴的なピークの強度の減少は、Venetin-1 の作用の結果として C. albicans 細胞壁のマンノタンパク質層が破壊されたことを示している可能性があります。 C. albicans 細胞壁の成分でもある多糖類に特徴的なシグナル強度の減少も観察されました。 Cryo-SEM 画像でも同様に細胞壁破壊の影響が示されました。 FTIR 分光研究では、脂質内で発生する結合に特有の振動に対応する信号強度の増加も示されました。 これは、C. albicans 細胞壁のマンノタンパク質層と β-グルカン層の破壊、および細胞膜の脂質層の露出に関する仮説を裏付けています。

C. albicans 細胞の細胞壁および膜に対する複合体の効果は、位相差顕微鏡を用いた真菌細胞の分析で見ることができ、不自然に拡大した液胞を持つ細胞が観察され、膜透過性の変化が示唆されます。 真菌細胞をフルコナゾールとインキュベートした後はそのような効果は観察されず、このことはこの抗生物質の作用機序が異なることを示しています。 リセニンおよびリセニン関連タンパク質 2 が複合体を構築する主要なタンパク質であることを示した我々の以前の研究を考慮すると 39、細胞膜透過性の変化に関する理論は理解できます。 リセニンタンパク質は主に真核生物と原核生物の両方の病原体に対する防御に関与していることが知られています。 ライセニンは膜受容体スフィンゴミエリンに結合します。 構造変化後に膜に付着すると、オリゴマーは膜に組み込まれます57。

ヘキストとヨウ化プロピジウムの混合物を使用して細胞分裂障害も分析しました。ヘキストとヨウ化プロピジウムは、遺伝物質を標識し、アポトーシス細胞や壊死細胞を示すことができます。 幹細胞の正しい分裂中に、核の 2 つの細胞への有糸分裂が起こります。 1 つの核が細胞質の一部とともに拡散して、芽と呼ばれる膨らみが形成されます。 芽は徐々に成長し、細胞壁によって幹細胞から分離されます。 体腔液複合体で処理した細胞では、母細胞と娘細胞の間に遺伝物質が分布していないことがよく観察されました。 娘細胞は親細胞から分裂することなく成長し、細胞間の狭窄部に核物質が見えました。 この効果は、フルコナゾールとのインキュベーションの場合には観察されませんでした。 Venetin-1 で処理し、Cryo-SEM および SEM で画像化した真菌細胞の切片では、分裂中に細胞壁と膜が細胞を明確に分離している対照細胞と比較して、出芽中の細胞分離が不完全であることが示されました。 複合体の作用後、娘細胞は親細胞から離れることができずに大きく成長し、その結果、細胞間にくびれのある細胞ダブレットが観察されました。 これは、核物質の異常な分裂と壁と膜システムの同時の混乱を示しています。 この細胞は、娘細胞の分裂を完了するために必要な成分が不足した状態で増殖しました。 フルコナゾールで処理した C. アルビカンス細胞は分裂を起こし、細胞間の核物質が完全に分離されました。これは文献データによって確認されています 34。

ローダミン 123 染色後に得られたデータは、Venetin-1 処理 C. albicans 細胞のミトコンドリア形状に明らかに目に見える変化があり、ミトコンドリア膜電位の損失を特徴とすることを示しました。 Fiołka らによって行われた研究 39 では、複合体で処理された真菌細胞では活性酸素種 (ROS) のレベルが上昇し、ROS 分解に関与するタンパク質のレベルが高くなっていることが実証されました。 酸化ストレスは、細胞構造の DNA、タンパク質、脂質化合物に損傷を与える可能性があります 58。 ミトコンドリア内の ROS レベルの増加は、ミトコンドリア膜のイオン チャネルの開口をもたらし、その結果、RIRR (ROS 誘導 ROS 放出) と呼ばれる現象が発生します。この現象では、ミトコンドリア膜電位の破壊により、電子伝達における ROS の生成が増加します。チェーン59、60。 酸化ストレスは細胞のアポトーシスまたは壊死を引き起こす可能性があり、C. albicans を Ventin-1 (以前は体腔液画分と呼ばれていた) で処理した後、両方の細胞死が観察されました 34,39,60。 フルコナゾール処理したカンジダ・アルビカンス細胞は、ローダミン 123 染色においてミトコンドリアの形態に変化を示さなかった。 フルコナゾール治療によって誘発される酸化ストレスによってミトコンドリアに及ぼされる影響は、ミトコンドリアの電子輸送の抑制によるミトコンドリアの機能障害に基づいており、これは可逆的です61、62、63、64。 ミトコンドリア機能の一時的な喪失は、フルコナゾール耐性のメカニズムとして文献に記載されています 62,65。

Venetin-1 複合体とフルコナゾールは両方とも多細胞凝集体の形成を誘導しました。 ただし、フローサイトメトリーでは細胞培養間の違いが明らかになりました。 サイトメーターの設計により単一細胞の分析が可能であるため、C. albicans の生存率の分析は、大きな凝集体や複雑な多細胞構造を形成していない細胞でのみ実行されました。 ただし、複合体の作用とフルコナゾールの作用の場合、凝集体形成効果は類似しており、すべての実験で同一の分析設定が適用されているため、フローサイトメトリーの結果を相互に比較できます。

フローサイトメトリーを用いて行われた活性ミトコンドリアの分析では、ベネチン-1とフルコナゾールで処理した細胞培養間の差異が示されました。 活性ミトコンドリアを有する細胞のレベルは同程度であるにもかかわらず、体腔液複合体による処理により、正常な細胞の割合が低下しました。 これは、Venetin-1 がミトコンドリアの変化を引き起こしたのに対し、フルコナゾールは変化を引き起こさなかったことを示しています。 これは、Venetin-1 の作用機序がフルコナゾールの作用機序とは異なることを示唆しています。 サイトメトリーの結果は、蛍光顕微鏡で調べたローダミン 123 染色細胞の観察、特にベネチン-1 で処理した培養物中のミトコンドリアの伸長と、フルコナゾールとのインキュベーション後のミトコンドリアに対する目に見える影響がないことを裏付けています。

フローサイトメトリーを使用して行われた細胞生存率分析では、100 μg mL-1 のベネチン-1 および 10 μg mL-1 のフルコナゾールとインキュベートした培養物中のアポトーシス細胞のレベルが同様であることが示されました。 この実験で得られたデータは、最高濃度の Venetin-1 が壊死性細胞死を引き起こすが、フルコナゾール処理後には観察されなかったことも示しています。 どちらの調製物も、対照培養物と比較して、細胞数を有意に減少させた。

感染症の治療に使用するための新しい治療薬の探索において重要な問題は、その適用性を制限する細胞毒性の欠如です。 フルコナゾールの場合、肝毒性と神経毒性 66,67 のほか、サル腎臓細胞株 68 および培養ヒト末梢血単核細胞 69 に対する細胞毒性および遺伝毒性効果が報告されています。 さらに、我々の以前の研究では、熱処理した D. veneta 体腔液と Venetin-1 は、ヒト線維芽細胞 70、正常なヒト結腸上皮細胞 (CCD 841 CoTr) 36、ヒト多血小板血漿 37、およびヒト気管支に対して細胞傷害作用を及ぼさないことが示されています。上皮細胞（BEAS-2B）35． 医療で使用するための新しい治療薬を探す場合、効果的な作用と細胞毒性の欠如（正常な細胞を救う）だけでなく、活性化合物の単離方法のコストと効率も考慮する必要があります。 これらの要件を考慮すると、体腔液から得られたベネチン-1複合体は、生物医学研究の候補の要件を理想的に満たします。 さらなる分析では、さまざまなカンジダ種に対する複合体の効果を調査し、複合体の構造を調査し、マウスモデルの生体におけるその作用を分析する予定です。

要約すると、分析されたミミズ製剤は、典型的な抗生物質とは異なる作用機序を有し、有望な抗真菌化合物であると思われるため、さらなる研究が促されている。

現在の研究中に使用および分析された生データは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

発表された研究は、ポーランド国立科学センターのプロジェクト [2020/37/B/NZ7/00763] によって支援されました。

マリア・キュリー・スクウォドフスカ大学、ルブリン、ポーランド、生物学およびバイオテクノロジー学部、生物科学研究所、免疫生物学部門

シルヴィア・ヴォイチク＝ミェシェフスカ & マルタ・J・フィオルカ

ポーランド、ルブリンのマリア・キュリー・スクウォドフスカ大学生物学・バイオテクノロジー学部生物科学研究所細胞生物学科

キンガ・ルータク

マリア・キュリー・スクウォドフスカ大学、ルブリン、ポーランド、化学学部、分析研究所

ウェロニカ・ソフィンスカ＝シュミエル

マリア・キュリー・スクウォドフスカ大学、ルブリン、ポーランド、生物学およびバイオテクノロジー学部生物科学研究所機能解剖学および細胞生物学部門

イエジ・ウィドリヒ

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SWM と MJF は主要な原稿テキストを書き、研究用に Venetin-1 を準備しました。 SWM はフローサイトメトリーを準備し、表 1、図、および図を作成しました。 1、2、3I、6、7、9; MF が図を準備しました。 3. I、4、5; WSC が作成した分光分析と図 10、表 2。 KL 製図 8; JW は顕微鏡分析を実施しました。 著者全員が原稿をレビューしました。

マルタ・J・フィオルカへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Wójcik-Mieszawska, S.、Lewtak, K.、Sofińska-Chmiel, W. 他ミミズの体腔液由来のベネチン-1複合体で処理したカンジダ・アルビカンス細胞の非定型変化。 Sci Rep 13、2844 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-29728-0

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受信日: 2022 年 11 月 21 日

受理日: 2023 年 2 月 9 日

公開日: 2023 年 2 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29728-0

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