脂質ナノ粒子内のメッセンジャーRNAがHEK 293細胞を脂質から救い出す | 北京アジャイルリフトベンチャーズグループ株式会社

Scientific Reports volume 12、記事番号: 22293 (2022) この記事を引用

2190 アクセス

5 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細胞生理学を研究するための分析ツールは、薬物と宿主の相互作用を最適化するために重要です。リアルタイムパルスチェイス NMR 分光法 (RTPC-NMR) は、mRNA の有無にかかわらず、COVID-19 ワクチン様脂質ナノ粒子 (LNP) で処理した HEK 293T 細胞における代謝産物生成の動態をモニタリングするために導入されました。代謝物への同位体標識の取り込みと細胞からの標識代謝物のクリアランスについて、速度論的フラックスパラメーターが解析されました。アラニン生成の特徴的な時間の変化は、細胞を脂質ナノ粒子 (LNP) で処理した結果としてのミトコンドリアの機能不全に関係しています。ミトコンドリアの機能不全は、LNP に mRNA を含めることによって大幅に軽減され、mRNA の存在により LNP のサイズと均一性が増加しました。この方法論はすべての培養細胞に適用できます。

細胞代謝による生来の翻訳機構を利用する、プソイドウリジン修飾 mRNA 脂質ナノ粒子 LNP ベースの新型コロナウイルス感染症ワクチンの目覚ましい成功により、この技術が医学の最前線に押し上げられています 1,2,3,4,5,6 。糖尿病 7、8、9、癌、遺伝性疾患 10、11 などの慢性疾患を治療するための mRNA LNP の多くの潜在的な応用がテストされています。メッセンジャー RNA ベースの治療法は、各用途に合わせて最適化する必要がある複雑な生体分子のセットを利用します。これらの細胞は、生体組織の希少な栄養資源をめぐって周囲の細胞と競争できるでしょうか? mRNA 遺伝子産物の効果的な生産はどれくらい持続しますか? mRNA LNP の分解によりメチルプソイドウリジンが放出されると、転写が阻害されるのでしょうか? LNPを構成する脂質は血漿や細胞内膜を損傷しますか? これらの問題は重要であり、治療の実施を促進するために対処する必要があります。

薬物治療に対する細胞の動的応答は、代謝プロファイリングによって評価できます。これは通常、質量分析法または NMR 分光法を使用して行われます 12、13。この方法では通常、総代謝産物濃度を検出するために細胞の溶解と抽出が必要であり、サンプルの調製に必要な多段階のプロセスにより本質的に偏った数時間から数日にわたる細胞生理学のスナップショットが得られます12、13。この侵襲的な方法論は代謝ネットワークの区画構造を破壊し、LNP ベースのワクチンの摂取後に起こる反応プロセスを反映していない可能性があります。リアルタイム NMR 分光法では、天然の 13C 存在量またはトレーサーベースの分析を使用して、細胞から 13C 同位体編集された 1H スペクトルを収集することで代謝産物を同定します。これにより、迅速なデータ取得が可能になり、それによって実験の時間分解能が 10 分以下に向上します 14,15。

最近のリアルタイム NMR ベースのメタボロミクス研究では、細胞を生理学的に活性な状態に維持するためにバイオリアクターを使用しており、遊離の細胞内代謝産物を検出できますが、数分にわたって起こる解糖などの重要な反応をモニタリングする機能がありません 16、17、18。。リアルタイムパルスチェイス NMR 分光法 (RTPC-NMR) の導入により、13C-グルコースおよび 13C 編集プロトン NMR の使用と、超高感度 NMR 凍結プローブ 19 および改良されたバイオリアクター 20 の設計が組み合わされて、実験の時間分解能が 47 秒に向上します。刺激に応じた代謝フラックスの急速な変化を追跡できるようになります。 13C 標識代謝産物は、標識されていないバックグラウンドに対して観察されます。この方法は、13C 炭素の取り込みのダイナミクスを公平な方法で捉え、刺激が代謝経路にどのような影響を与えるかを明らかにすることにより、細胞の健康状態を分析するための最先端の技術を表します。

ウリジンの代わりに N1-メチルプソイドウリジンを含む修飾ルシフェラーゼ mRNA を、以前に公開されたプロトコール 21,22 に基づいて in vitro 転写によって調製し、すべての実験に使用しました。 N1-メチルプソイドウリジンを組み込むと、mRNA の安定性が向上し、哺乳類細胞におけるタンパク質発現が強化されます 22,23。精製された転写産物には、タンパク質の翻訳をさらに促進するために、〜150ヌクレオチドの3'ポリ(A)テールおよび5'Cap124が含まれていました(補足図1)。 5 つのトランスフェクション試薬を使用して、修飾された mRNA を HEK 293T 細胞に 24 時間トランスフェクトしました (図 1a、補足表 1)。 HEK 293T 細胞は、ルシフェラーゼ mRNA の取り込みと発現をモニタリングするために以前に利用されました 21,22。 Kariko et al.21,22 と一致して、1 つの試薬、リポフェクタミン 2000、LF のみが、ルシフェラーゼ依存性発光シグナルを生成するのに十分な mRNA を細胞に送達しました。

リポフェクタミンは、HEK 293T 細胞にトランスフェクトされた mRNA の安定性を高めます。 (a)。細胞は、5 つの異なる試薬を使用して修飾ルシフェラーゼ mRNA で 24 時間トランスフェクトされ、結果として生じるルシフェラーゼ発光活性が定量されました。コントロールには、ベースライン発光を評価するための mRNA もトランスフェクション試薬も含まれていません。バーは相対誤差を示します。 (b)。裸の修飾ルシフェラーゼ mRNA による VECT トランスフェクション (四角) および修飾ルシフェラーゼ mRNA による LF 媒介トランスフェクション (丸) から生じる発光。 (c)。 LF-mRNAで異なる時間処理したHEK 293T細胞の発光。サンプルは連続的に (実線、丸)、または 8 時間 (点線、四角)、または 12 時間 (破線、三角) 処理されました。

対流移動のための体積交換、VECT 技術 25,26 を使用して、裸の mRNA を HEK 293T 細胞にトランスフェクトしました。化学的に修飾された塩基にもかかわらず、タンパク質生成は制限され、ルシフェラーゼ依存性シグナルは急速に減少しました（図1b、補足表2）。同じ mRNA の LF 媒介トランスフェクションにより、持続的なタンパク質発現がもたらされました。このデータは、修飾された mRNA であっても非常に不安定であり、トランスフェクション試薬を利用して mRNA を分解から保護することが持続的なタンパク質発現にとって重要であることを示唆しています。

代謝研究の分析ウィンドウを確立するために、HEK 293 T 細胞を LF-mRNA LNP とさまざまな時間インキュベートすることにより、タンパク質発現の程度を調べました。連続的に処理したサンプル、または 8 時間または 12 時間処理したサンプルは、同じ時間経過にわたって同等の量のルシフェラーゼ依存活性を生成しました (図 1c、補足表 3)。最大のタンパク質発現は、連続トランスフェクションおよび 8 時間のトランスフェクションでは約 15 時間で観察されましたが、12 時間のトランスフェクションでは約 20 時間でピーク発現が示されました。その後のトランスフェクションはすべて、タンパク質生産を最大化し、実験の便宜のために 10 時間インキュベートしました。

LNP の相対的な安定性と有効性は粒子径と分散度の関数であり、生体内分布、組織浸透、積荷の積載と放出、および組織への細胞取り込みの効率を制御します 27、28、29。培養細胞の場合、より小さい粒子を迅速に除去することで組織への浸透を最小限に抑える循環系およびリンパ系が存在しないため、LNP サイズはカーゴの送達を可能にする上であまり役割を果たさないと予想されます。 LNP は、界面活性剤二重層によって安定化された水性内部を持つ多分散リポソーム構造を形成します。水性コアは mRNA に安定した環境を提供し、裸の mRNA と比較して早期分解を軽減します 30,31。 LFとの相互作用におけるmRNAの役割を確認するために、mRNAの有無にかかわらずLNPを組み立て、電子顕微鏡イメージングのために酢酸ウラニルでネガティブ染色しました（図2）。 mRNAが存在しない場合、LNPのサイズ分布は非対称で、平均粒子サイズは29±12nmでした（図2aおよびc）。 LF LNPにmRNAカーゴを含めると、粒子サイズの平均が135±12 nm（図2bおよびd）で、成功裏に使用されたものの100〜200 nmの範囲内にある、より大きくて多分散性の低い粒子サイズの集団が得られました。透過性の高い腫瘍に抗がん剤を投与する32。

脂質ナノ粒子のサイズはmRNAによって安定化されます。 (a) mRNA を含まないリポソームの電子顕微鏡写真。 (b) ルシフェラーゼ mRNA を含むリポソームの電子顕微鏡写真。 (c) mRNA を含まない LNP のサイズ分布。 (d) ルシフェラーゼ mRNA を含む LNP のサイズ分布。ガウス曲線は、分布の比較視覚化を容易にするために描かれています。

パルスチェイス機能は、前述のリアルタイム、RT、NMR バイオリアクターに追加されました 33。バイオリアクターは、高エネルギーチャージと代謝的に活性な細胞と一致して、高レベルのリン酸含有代謝産物を 24 時間以上維持します 33。 HEK 293T 細胞は、以前に記載されているように、アトマイザー 20 と、心筋細胞の研究に使用される古典的な化学的に定義された無血清培地である改良型 Krebs-Henseleit, KH 緩衝液 34 を使用して、小さな直径約 0.6 mm のアルギン酸ビーズにパッケージングされました。 KH 緩衝塩には、グルコース、ウシ血清アルブミン、BSA、インスリン、およびパルミチン酸が補充されました。バイオリアクターの重要な特徴は、5 mm NMR チューブ内の充填細胞ビーズ 33 全体に新鮮な培地の均一な分布を可能にし、約 200 μL の NMR サンプリング容量からの培地の迅速な交換を容易にする微多孔性灌注ステム (図 3a) です。均一に標識された [U, 13C]-グルコースの 15 mL パルスを、媒体送達チューブと並んで取り付けられ、機械的スイッチによって制御された注入ループを通じて投与しました (図 3a)。気泡の形成を避けるために、チューブの内径はデバイス全体のジョイントのオリフィスと一致しました。流量は蠕動ポンプによって制御され、100 ～ 200 uL/分が送達されました。デバイスの性能は、解糖の特徴的な時間である 10 ～ 20 分よりも速い、立ち上がり時間約 10 分で標識グルコースのパルスを導入するように最適化されました36。そのために、実験温度を 300 K に調整して細胞代謝を遅らせました 37。最適化の実行により、アルギン酸ビーズにパッケージ化され、微多孔性洗浄ステムを使用して供給された 1,000 万個の細胞が、実験中に投与された 13C-グルコースの約 25% を消費できることが示されました (補足図 2)。

リアルタイムパルスチェイスNMR分光法。 (a) RT-PC NMR に使用されるバイオリアクター。改造されたバイオリアクターには、パルスチェイス実験用の注入可能なループまたはステップチェイス実験用のバルブが含まれています。 (b) 細胞内に存在する代謝物を示す 13C 編集済みヘテロ核単一量子コヒーレンス、1H-13C HSQC、NMR スペクトル。挿入図は、代謝物のクロスピーク分割とグリコーゲンのクロスピークを示しています。 2D 1H-13C HSQC のプロトン次元への投影はスペクトルの頂点にあります。エタノールのピークは、改質 KH 緩衝液中でパルミチン酸サプリメントを可溶化するためにエタノールが使用されたために発生します。シグナル対ノイズ比が低いため、または 1H 軸への投影後に緩衝液またはグルコースのピークと重複するため、分析に使用されなかった代謝産物からの標識されていないピークは、アスタリスクで示されます。（c）非トランスフェクトHEK 293T細胞において非標識グルコースで追跡した正規化13C-グルコースパルス：（I）パルスの前に、細胞に改変KH緩衝液中の非標識グルコースを供給する。 (II) 取り込み段階では、13C-グルコースの 15 mL パルスが注射可能なループを通じて導入されます。 (III) 13C-グルコースはプラトー濃度に達します。 (IV) クリアランス段階では、13C-グルコースがシステムから除去されます。すべての段階で、個々の代謝産物が代謝経路を進むにつれてモニタリングされます。赤と黒の痕跡は生物学的複製サンプルを表します。 (d) パネル c に示されているパルスの前縁と後縁の立ち上がり時間と立ち下がり時間、tRG と tFG。

リン NMR スペクトルを収集することにより、各実験の前後に細胞の ATP レベルを監視しました。生細胞は、1D スペクトルで容易に識別できる恒常性レベルの ATP を維持します。結果は、各実験の過程でATPレベルの低下が見られなかった(補足図3)。細胞内 pH は、クレアチンリン酸、PCr、および無機リン酸塩 Pi のピークのそれぞれ - 3.18 ppm と 2.13 ppm の違いに基づいて、7.2 ～ 7.5 の間であると推定されました 38,39。酸素化は PCr/ATP 比によって評価され、~0.6 であることが判明しました。これは、灌流されたラット腎臓で通常観察される範囲内です (補足図 3)40。この比率は実験の過程で変化せず、アルギン酸ビーズの高密度パッケージングにもかかわらず、細胞が低酸素状態ではないことを示しました 41,42。

一次元 13C 編集プロトン NMR 実験 43 を使用して、同位体標識されたグルコースから代謝される炭素をモニタリングしました 43。代謝産物からのプロトンシグナルは重複しているため、プロトンスペクトルに存在する代謝産物を同定するために、最初に二次元の13C編集ヘテロ核単一量子コヒーレンス、HSQC43、NMRスペクトルが取得されました（図3b）。グルタミン酸のHγ-Cγ、アラニンのHβ-Cβ、および乳酸のHγ-Cγからのピークのみが、プロトン次元に投影した後に重なりませんでした（図3b）。観察された炭素次元の分割は、乳酸、アラニン、およびグルタミン酸が解糖と単一の TCA サイクルの生成物であることを示しました (図 3b 挿入図)44。継続的なグルコース供給のため、糖新生からの有意な寄与は期待されなかった。乳酸、アラニン、およびグルタミン酸に対応する重複しないピークは、取得時間を実験の時間分解能である 47 秒に短縮するのに十分な強度を持っていました。

未処理のHEK 293T細胞における13C-グルコースのパルスプロファイルを図3cに示します。同位体標識されたグルコースが NMR チューブに入ると、信号が急速に上昇しました。シグナルはプラトー濃度に達し、13C-グルコースが標識されていないグルコースによって追いかけられるにつれて減少しました。グルコースパルスの前縁と後縁の非理想性は、それぞれ立ち上がり時間と立ち下がり時間、tRG、tFGで表され、パルスチェイスプロファイルを単相の指数関数的な会合/減衰に当てはめることで解決されました（補足図） 4、および補足表4）。パルスがシステムに出入りするときに拡散速度の差が生じ、その結果、立ち下がり時間が大幅に長くなります（補足図5）。これらの違いは、部分的には、各物理サンプルに関連する細胞充填密度の変動の結果です。

HEK 293T 細胞をプレート上の OptiMEM で増殖させ、未処理のまま放置するか (コントロール)、または LF または LF-mRNA で一晩処理しました。標識されたグルコースが代謝されるにつれて、乳酸、アラニン、およびグルタミン酸の運命が監視されました（図4）。各実験は完了するまでに約 6 時間かかり、生物学的複製を使用して少なくとも 2 回繰り返されました。標識されたグルコースとは異なり、代謝産物の最大クロスピーク強度は個々の実験間で 2 倍変化しましたが、時間プロファイルは変化しませんでした。各細胞調製物による代謝産物の絶対濃度の変動は、増殖に変化がなくても存在する生細胞の固有（クローン）不均一性を反映しており、生物学的複製サンプルでは予期されないものではありません 45,46。代謝産物のクロスピーク強度は、標識代謝産物が生合成後にフリープールに入ると増加し、それらが一時的に結合またはより大きな生体分子に組み込まれると、または標識グルコースが系から除去されたときにフリープールから除去されると減少しました。

HEK 293T 細胞における代謝産物のスケーリングされた速度分布プロファイル。 (a) RTPC-NMR 実験中に観察された 13C-グルコースの代謝的性質を示す図。（ b ）HEK 293T細胞における15 mLの13C-グルコースパルスおよびLFで10時間処理したHEK 293T細胞における13C-グルコースの連続供給から生じる代謝産物の動態フラックスプロファイル。赤と黒の痕跡は生物学的複製サンプルを表します。

均一な栄養流の条件下では、パルスチェイスプロファイルの前縁/後縁は、遊離代謝産物の濃度の指数関数的な増加/減少を示しました。個々の標識された代謝産物の生成の速度論的パラメーターを推定するために、2 つの実験からの KFP がスケーリングされ、13C グルコースパルスの実際の形状を考慮した 2 相指数関数にリーディングエッジが適合しました。

ここで、y は遊離代謝産物の相対濃度、tP は代謝産物シグナルが約 63% 飽和に達するのに必要な生成時間、yPo はシグナルが増加し始めるときの相対濃度、ARo と AP は定数です。フリープールからの標識代謝物のクリアランスの速度論的パラメーターを推定するために、プロファイルの後縁も 2 相指数関数に当てはめました。

ここで、tC は代謝産物シグナルが 63% 減少するクリアランス時間、yCo はシグナルが減少し始めるときの相対濃度、AFo と AC は定数です。方程式の最初の項。（1）および（2）は、tRGおよびtFGが代謝産物のtPおよびtCよりそれほど短くない場合、拡散による13C-グルコースパルスの非理想性を考慮しています（図3cおよびdおよび補足表4）。

LFまたはLF-mRNA処理を受けなかった対照HEK 293T細胞は、乳酸、アラニン、およびグルタミン酸について明確なリーディングエッジおよびトレーリングエッジプロファイルを示しました（図4）。乳酸レベルは同位体定常状態 47 に達し、標識されたグルコースが追跡されるまで持続しました。アラニンは、対照条件下でプラトーレベルの小さな着実な低下を示しました。グルタミン酸のプロファイルは、標識されたグルコースパルスがシステムから追い出された頃に最大に達しました。

生成、tP、およびクリアランス、tC について分解された平均時定数は、乳酸塩の場合はそれぞれ 14 分と 26 分、アラニンの場合は 13 分と 30 分でした（補足表 5、補足図 6 および 7）。これは、乳酸塩、ピルビン酸に由来するアラニンとアラニンは解糖の生成物であり、解糖は最も速い代謝経路であり、サイトゾルで発生します（図4）。 TCAサイクル中にα-ケトグルタル酸からミトコンドリアで合成されるグルタミン酸は、解糖生成物に依存し、代謝産物の出入りが遅いため、生成とクリアランスに最も遅い平均時間75分と60分を示しました。ミトコンドリア (補足表 5、および補足図 8)。

LFまたはLF-mRNAで処理した細胞における乳酸およびアラニンの動態フラックスプロファイルは、対照と定性的に同様であり（図4）、標識代謝物の結合画分により、tPと比較してtCの小さいが有意な増加を示しました（補足表5）。またはそれらの前駆体（補足表5、図5a）。乳酸塩とアラニンのクリアランス時間が持続的に遅いことは、遊離標識代謝産物が結合画分から交換され、進行中の代謝に利用されるにつれて、遊離標識代謝産物の濃度が増加することを反映しています。グルタミン酸の tP と tC の差は有意ではありませんでした（補足表 5、図 5a）。これはおそらく、グルタミン酸の遊離細胞内濃度が通常、乳酸またはアラニンよりも約 20 倍高く 48、結合した標識グルタミン酸が実質的に変化しないためであると考えられます。自由な集中力。最も顕著な偏差は、LF に曝露された細胞のアラニンで観察されました (図 4)。これは、対照細胞で観察された同位体定常状態のプラトーが、標識されたグルコースパルスが照射された場合の信号強度の単調減少とそれに続く急速な指数関数的減少によって置き換えられました。削除されました。細胞をLF-mRNAで処理すると、同位体定常状態のアラニンレベルが回復した。

KFP パラメーター間の差異の統計的評価 (a) 産生時間とクリアランス時間、tP および tC。 (b) 各代謝産物の特性時間、tch = 2/(1/tP + 1/tC)、(c) 結合パラメーター、K = (1/tP—1/tC)/2、および (d) 傾きLF および LF-mRNA で処理した後のアラニン KFP の変化。点は、生物学的複製サンプルを使用して取得されたデータポイントを表します。星印は有意性を示します: p < .05 (*)、p < .01 (**)、および p < .001 (***)。

乳酸はバイオリアクターのフロースルーでも検出され、したがって細胞から排泄されることに注意してください（補足図2）が、乳酸生成速度である排泄速度は〜1/20 min-1です（表1）、200 μL/分の栄養流量を 200 μL の NMR サンプリング量で割った値 (1 min−1) よりもはるかに遅いです。その結果、ほとんどの細胞内で標識された乳酸が観察されます。乳酸およびアラニンの産生時間（tP）は、対照と比較して、LF-mRNA処理HEK 293 T細胞において有意に遅かった（図5a;補足表5）。グルタミン酸プロファイルは、LF または LF-mRNA で処理した細胞において一貫して高い実験誤差を示しました。これは、生物学的複製に固有のサンプリングノイズ、または異常なミトコンドリア活性の兆候、またはその両方の結果である可能性があります。

あらゆる条件下での結合画分への代謝産物の同位体定常状態の取り込みと遊離代謝産物の蓄積は、結合部位の競合の単純なモデルによって説明できます (式 (14) および (15) を参照)。このモデルは、結合部位をめぐる標識代謝産物と未標識代謝産物の間の競合により、tPが短くなり、tCが長くなることが予測されます（式11および13、補足表5、補足図9）。このモデルでは、代謝産物フラックスの特性時間 tch は tP と tC の間の調和平均に等しく、標識されたグルコースの結合画分への取り込みおよび結合画分からの放出の時間を表す特性結合パラメーター K は等しいです。は、1/tP と 1/tC の差の半分に相当し、結合部位の濃度にオン速度を掛けたものに相当します (表 1)。

LFまたはLF-mRNAで処理した後の乳酸およびグルタミン酸の代謝、またはLFで処理したアラニンについては、tchの有意差は解決されず（表1、図5）、解糖およびミトコンドリアの代謝フラックスが乱れていないことを示しています。 LF-mRNAの存在下では、対照細胞と比較して、アラニン代謝のtchに有意な増加があった（図5b）。この増加は、LF-mRNA で処理した細胞におけるアラニン代謝の変化を示しており、これにより、アラニンフリープールの利用時間が増加し、その結果、結合画分が増加したり、アラニン生成が減少したりする可能性があります。ただし、各代謝産物について分解された K 値は有意な差はなく、結合代謝産物と遊離代謝産物の代謝分布が LF または LF-mRNA の存在によって影響を受けないことを意味します（図 5c; 表 1）。グルタミン酸に関して解決された負の値は、それらの測定に関連する大きな誤差の結果として生じました。

アラニン代謝に関連する摂動をさらに調査するために、標識グルコースの階段関数を LF で 10 時間処理した細胞に適用しました (図 4)。注入ループを、入口の流れを 13 C-グルコース培地を含むリザーバーに切り替えるバルブに置き換えました。乳酸塩とグルタミン酸塩は同位体定常状態挙動を示しましたが、アラニンのプロファイルは最大値に達し、実験の過程で単調減少し、これはパルス実験の約 2 倍長く続きました。アラニンのプラトー信号強度の減少は、アラニンプラトープロファイルを一次関数に当てはめることによって分析されました（補足表6、図5d）。 LFで処理した細胞で分解された傾きの平均値0.005 min-1は、対照よりも2.5倍大きくなる傾向にあり、LF-mRNAで処理された細胞よりも有意に5倍大きくなりました(補足表6)。これは、プロセスが非常に遅いことを示しています。 (図5d)。結合アラニンと遊離アラニンの分布は乱れず、少量の排泄アラニンは実験中一定のままであったため(補足図10)、アラニンプラトーの傾きはアラニン生合成の減少を反映している可能性が最も高い。アラニン合成の大部分は、ピルビン酸のアミド化によるアラニンの生合成において、ミトコンドリアのTCAサイクルの生成物であるα-ケトグルタル酸に由来するグルタミン酸の利用可能性に依存しており、ミトコンドリアからのグルタミン酸の輸送が不十分であることを示している可能性があります（図） .4a)。また、欠陥のあるミトコンドリアにおけるグルタミン代謝の再配線によってアラニンレベルが影響を受ける可能性もあり49、ミトコンドリアが活性酸素種（ROS）の生成によって損なわれると、グルタミン酸の生成も損なわれる可能性があります。どちらの条件もアラニン生合成時間の短縮につながる可能性があります。

リポフェクタミン 50 で処理した神経前駆細胞では、ミトコンドリア機能の破壊、膜脱分極、電子伝達不全が観察されています。内膜上の電子伝達系からの電子漏洩は酸素の部分的な還元を引き起こし、最終的にマイトファジーを引き起こす可能性のあるスーパーオキシド、ROS を形成します。ミトコンドリア機能がLFの影響を受けるかどうかを調べるために、ミトコンドリアROSによって酸化されると蛍光を発するMitoSOXでHEK 293T細胞を処理し、画像化（図6a）およびアッセイ（図6b）を行った。

mRNAの有無にかかわらず、LNP曝露に応答したHEK 293T細胞におけるROS産生。 (a) MitoSOX 染色された細胞は、ROS の存在を明らかにします (赤色で色付けされています)。ディープレッド FM 染色 (緑色) は、無傷のミトコンドリアを示しています。オーバーレイパネルは、ROS がミトコンドリアに由来することを示しています。 (b) 細胞内の MitoSOX 蛍光の定量。点は、技術的な反復サンプルを使用して取得されたデータポイントを表します。エラーバーは平均偏差を表します。星印は有意性を示します: p < .05 (*)、p < .01 (**)、および p < .001 (***)。

ROS のポジティブコントロールであるアンチマイシン A で細胞を処理すると、チトクロム c レダクターゼの Qi 活性部位に結合して細胞呼吸を阻害し、未処理の細胞と比較してミトコンドリア ROS が大幅に増加しました (図 6b)。 LF で処理し 4 時間インキュベートした細胞は、未処理の細胞と比較して有意に高いレベルの ROS を示し、その差は 28 時間のインキュベーションが長くなると増大しました。 LNPにmRNAを含めると、4時間のインキュベーション後の未処理細胞と同様に、LF単独と比較してROSレベルが大幅に低下し（図6b）、細胞内RTPC-NMRメタボロミクスにおけるアラニンの同位体定常状態プラトーが回復しました。実験（図4）。無傷のミトコンドリアおよびdsDNAの染色では、マイトファジー反応またはオートファジー反応に違いがないことが示されました（図6a）。したがって、アラニン生合成の明らかな減少は、ROS を引き起こす LF 誘発ミトコンドリア機能不全によるものである可能性があります。

LNP 媒介 mRNA ワクチンが治療法として広く利用可能になるにつれ、細胞や組織に対する LNP の影響を理解することがより重要になります 5。メッセンジャー RNA だけでは、たとえ修飾塩基を含むものであっても、トランスフェクション剤として使用するには不安定すぎるためです。 mRNA が細胞によって効果的に利用されるためには、特定の LNP によって保護される必要があります。しかし、LNP は有毒です50。ワクチン類似体の脂質部分は、ROSの増加という形でミトコンドリア膜の機能不全を引き起こすようだが、その影響はmRNAをLNPに含めることで軽減された。 mRNAを含むLNPで処理したHEK 293T細胞は、24時間以上栄養素にアクセスしてタンパク質を産生することができ、これは、mRNA分解時に避けられないプソイドウリジンの放出がmRNA産物の転写を阻害しないことを意味する。この技術は遊離代謝産物に敏感ですが、グリコーゲンなどの共有結合 52 またはタンパク質-リガンド相互作用 53 などの非共有結合の結合代謝産物プールに関する情報が含まれています。 LNP の有害な影響を評価するための新興技術として細胞内メタボロミクスを使用すると、LNP の有効性を最適化し、起こり得るオフターゲット効果に対処するのに役立ちます54。

ほとんどの代謝方法論は、細胞内分配を破壊し、代謝プールを希釈することによって、遊離代謝産物と結合代謝産物の間の分布を変化させる細胞生理学のスナップショットを提供します 36。リアルタイムパルスチェイスNMRは、バイオリアクター内の細胞に同位体標識13C-グルコースのパルスを導入し、生細胞内での標識代謝物の取り込みとクリアランスの時間を直接モニタリングすることにより、これらの合併症を回避します。一次元 13C 編集プロトン NMR パルスシーケンスを使用することにより、標識化合物のみが観察されます。 NMR信号強度は、13C-グルコースが導入されると遊離標識代謝産物の細胞内レベルが生成されるにつれて増加し、それらが中間代謝に取り込まれたり、パルスが除去されたときに一時的に結合またはシステムから除去されたりするにつれて減少します。スペクトル取得時間が短いため、時間分解能は 47 秒で、解糖などの急速なプロセスの開始を観察するのに十分な速さです。

RTPC-NMR 分光法は、mRNA-LNP ワクチン類似体に応答した同位体定常状態の栄養フラックス条件下での HEK 293T 細胞のエネルギー産生経路の活性のモニタリングと、mRNA-LNP ワクチン類似体の導入による代謝フラックスの変化の特定に有効であることが示されました。治療用化合物。プロトン 13C 編集 NMR スペクトルでは、乳酸塩、アラニン、グルタミン酸塩の 3 種がよく分離されました。これらは細胞内で最も豊富な代謝産物の 1 つです48。代謝産物の蓄積は、細胞エネルギーの抽出に関与するよく理解されている代謝経路の進行に従いました。それぞれについて生成された反応速度論プロファイルは、一次反応速度論を使用して分析され、それぞれ細胞からの標識代謝物の生成および除去に関する時定数 tP および tC が得られました。実験的に導出されたパラメーターにより、代謝フラックス tch の特徴的な時間、およびフラックス K に対する代謝産物の結合画分の寄与が解明されました。乳酸とアラニンは、サイトゾルで起こり、解糖によって最も速く生成され、解糖によって生成されます。ブドウ糖の存在。ミトコンドリアにおけるグルタミン酸合成は解糖系と TCA 回路の生成物に依存しており、よりゆっくりと起こりました (表 1)。

対照条件下で観察された乳酸とアラニンの急速な蓄積は、mRNA の有無にかかわらず LNP を添加してもほとんど影響を受けませんでした。一貫して遅いクリアランス時間は、結合画分への遊離標識代謝産物またはその前駆体の取り込みに起因し、パルスが細胞から追い出されるにつれてゆっくりと放出されました。 LF-mRNA 処理細胞におけるアラニンの特性時間の大幅な増加は、細胞増殖の遅延 55 と好気性解糖の減少をもたらす、前述の組換えタンパク質産生の代謝負荷を示しています 56,57。アラニンクリアランスのプラトープロファイルの明確な変化は、TCAサイクルを介したグルタミン酸産生が妨げられないまま細胞をLNPのみで処理した結果として、グルタミン酸輸出におけるミトコンドリアの機能不全に関係している。この仮説は、LNP で処理した細胞における ROS の存在によって裏付けられました。 LNP に mRNA を含めることにより、ROS の程度が大幅に軽減され、制御行動が大幅に回復しました。この結果は、アラニンが LNP 誘発毒性の高感度プローブとして機能する可能性があることを示唆しています。

LNP への mRNA の組み込みは、強力な遺伝子発現のために必要であることが示されました。 mRNA をカプセル化すると、LNP の平均サイズが 29 nm から 135 nm に増加し、安定性と有効性にとって重要なパラメーターであるより対称的な分散性が得られました。この研究では、メーカーのプロトコールを使用して、mRNA を含むまたは含まない LNP を調製しました。得られる粒子のサイズ分布を変える試みは行われなかった。

内部移行した LNP は、そのサイズに反比例する速度で細胞媒体を通って拡散します。我々は、脂質とRNAの相互作用の欠如によってもたらされる安定性の向上と相まって、より小さなLNPの急速な拡散58が、長寿命でより深く浸透するLNPをもたらし、ミトコンドリアを含む内部膜構造と相互作用して損傷することができると推測している。これは、空の LNP がどのようにして貨物を積んだ LNP よりも多くの ROS 産生を引き起こすのか、そしてアラニンの一次生合成におけるグルタミン酸の適切なミトコンドリア輸送の要件と組み合わせて、なぜ mRNA の有無でアラニンプロファイルのみが異なるのかを説明する可能性があります。。

ヒト胎児腎臓細胞 HEK293T は、American Type Culture Collection から購入し、推奨条件に従って培養しました。 N1-メチルプソイドウリジン-三リン酸は、TriLink Biotechnologies から購入しました。トランスフェクション試薬 Fugene 6、Fugene HD、ViaFect、および Luciferase Assay System キットは Promega から入手しました。直鎖PEI (25 kDa) はPolysciencesから、ロテノンはMP Biomedicalsから、そしてアンチマイシンAはSigma-Aldrichから購入しました。リポフェクタミン 2000、LF、ダルベッコ変法イーグル培地、DMEM、Opti-MEM 低減血清培地、リン酸緩衝生理食塩水、PBS、および MitoSOX は ThermoFisher Scientific から入手しました。ホタルルシフェラーゼ mRNA のインビトロ転写に使用したプラスミド pTK305 は、Addgene から購入しました (プラスミド # 66,812; http://n2t.net/addgene:66812; RRID:Addgene_66812)。

プラスミドｐＴＫ３０５を増幅し、制限酵素ＡｓｃＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で直線化し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール／酢酸アンモニウムで沈殿させた。直鎖状 DNA を 1 mg/mL の濃度で RNAse-free Tris-EDTA、TE バッファーに再溶解し、未修飾ヌクレオチドまたは N1-反応においてウリジン三リン酸をメチルプソイドウリジン三リン酸に置き換えます。 mRNA合成は、製造業者のプロトコールに従って実施した。得られた mRNA を、-20 °C で 30 分間以上、7.5 M 塩化リチウム、50 mM EDTA、LiCl/EDTA で沈殿させることによって精製しました。ペレットをＲＮＡｓｅを含まない水に溶解した。

5' 末端に Cap1 構造を導入するために、mRNA を 65 °C で 10 分間変性させ、メーカーのガイドラインに従って ScriptCap™ Cap1 Capping System (Cellscript) を使用しました。反応は、半分の容量のＬｉＣｌ／ＥＤＴＡ溶液を添加することによって停止され、ＲＮａｓｅを含まない水に再溶解された。 3' ポリ(A) テールを追加するために、mRNA を 65 °C で 10 分間再度変性させ、A-Plus™ ポリ(A) ポリメラーゼテーリングキット (Cellscript) をメーカーのガイドラインに従って使用しました。反応を37℃で2時間インキュベートし、EDTAを15 mMまで添加して反応を停止させた。等量の5M酢酸アンモニウムを加え、氷上でインキュベートし、沈殿を遠心分離することによってmRNAを精製した。得られたポリアデニル化され、キャップされた N1-メチルプソイドウリジン mRNA を 1 mg/mL の濃度で RNase フリー水に溶解し、等分して、-70 °C で保存しました。

HEK 293T 細胞は、完全培地、ダルベッコ改変イーグル培地、4 mM L-グルタミン、5.5 mM D-グルコース、1 mM ピルビン酸ナトリウム、10% ウシ胎児血清 (HyClone)、100 単位/mL のペニシリンを添加した DMEM で増殖させました。 100 mg/mLのストレプトマイシン。トランスフェクション効率を測定するために、24 ウェルプレート内の 5 つの異なる試薬で細胞をトランスフェクトしました (トランスフェクションごとに 2 ウェル)。トランスフェクションの24時間前に、各ウェルに0.5 mLのDMEM/10% FBS中の5×104細胞を播種し、5% CO2の増殖チャンバー内で37℃でインキュベートしました。増殖培地を Opti-MEM/5% FBS に変更し、0.5 μg のルシフェラーゼ mRNA を 1.5 μL の FuGENE 6、1.5 μL の FuGENE HD、2 μL の ViaFect または 1 μL の LF と Opti-MEM 中で混合し、インキュベートしました。メーカーの推奨に従って室温で。 1 mg/mL の直鎖状ポリエチレンイミン PEI 2.5 μL を、Opti-MEM 47 μL 中のルシフェラーゼ mRNA 0.5 μg と混合し、室温で 20 分間インキュベートしました。未処理の HEK 293T 細胞を自己発光コントロールとして使用しました。トランスフェクション混合物をウェルプレートに移し、増殖チャンバー内で 24 時間インキュベートしました。細胞をＰＢＳで洗浄し、５０μＬの１Ｘルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて溶解した。細胞を掻き取り、ウェルの内容物を16,000 gで5分間遠心分離しました。上清を新しいチューブに移し、-70 °C で保存しました。ルシフェラーゼ活性をアッセイするには、96 ウェル白色プレート (Greiner Bio-One) 内で 20 μL のライセートを 100 μL のルシフェラーゼアッセイ試薬 (Promega) と混合し、すぐに Synergy H1 ハイブリッドマルチモードプレートリーダー (BioTek Instruments) で読み取りました。。これらの実験で使用される LF 試薬は、ポリカチオン性脂質とリン脂質の混合物で構成されていることに注意してください。核酸カーゴを含む LNP の形成は、核酸ポリマーのリン酸骨格と正に荷電した脂質の間の静電相互作用を通じて起こります 59。

時間経過実験では、トランスフェクトされた細胞を 10 cm プレート上で 60 ～ 80% コンフルエントになるまで増殖させ、0.25% トリプシン - EDTA (Gibco) を使用して 37 °C で 5 ～ 10 分間回収しました。完全培地で５倍希釈してトリプシンを中和し、細胞を計数し、２００ｇで１０分間遠心分離してペレット化した。細胞を Opti-MEM/5% FBS に 0.6 ～ 1 × 106 細胞/mL の濃度で再懸濁し、1.5 mL エッペンドルフチューブに 1 チューブあたり 0.5 mL ずつ分注しました。チューブは、蓋を開けて角度を付けて増殖チャンバー内でインキュベートしました。各トランスフェクションでは、2 μL の LF を 23 μL の Opti-MEM と混合し、37 °C で 5 分間インキュベートしました。 25 μL の Opti-MEM 中の 1 μg の mRNA を加え、インキュベーションを 20 分間続けました。トランスフェクション混合物を細胞に添加し、チューブを増殖チャンバー内に配置した。適切な時間に、細胞を２００ｇで５分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、発光アッセイについて上述したように溶解した。一部の実験では、トランスフェクションの 8 時間または 12 時間後に培地を除去し、さらなるインキュベーションのために DMEM に置き換えました。 mRNA 送達にマイクロフルイディクスを使用した場合 (下記)、処理した細胞を Opti-MEM/5% FBS に再懸濁し、1.5 mL エッペンドルフチューブに 1 チューブあたり 0.5 mL ずつ入れ、増殖チャンバー内で指定時間インキュベートし、遠心分離して溶解しました。その上。

NMR 実験用の細胞は、20 mL の DMEM/10% FBS 中で 15 cm プレート上で 60 ～ 80% コンフルエントになるまで増殖させました。トランスフェクション混合物を 100 倍にスケールアップしました。つまり、100 μg の mRNA を含むまたは含まない、2.5 mL の Opti-MEM 中の 200 μL の LF です。 20 分間のインキュベーション後、トランスフェクション混合物をプレートに添加し、37 °C、5% CO2 の増殖チャンバー内で 10 ～ 11 時間トランスフェクションを進行させました。

培地を含む 3 つの 15 cm 培養ディッシュ (Corning) に 4 × 106 HEK 293T 細胞を播種し、5% CO2、37 °C で 48 ～ 72 時間、約 80% コンフルエンス (約 1.2 × 107 細胞/プレート) になるまでインキュベートしました。細胞を上記のように採取し 60、凝集と凝集を減らすために 40 μm フィルターに通し、計数しました。約 3 × 107 個の細胞をセルフローバッファー、0.4% BSA、0.04% EDTA、20% Percoll、および 5 µL の Tween-20 に懸濁し、保存バッファー中の修飾ホタルルシフェラーゼ mRNA を最終濃度 300 µM で添加しました。容量は3mL。剛性の 9.6 μm マイクロチャネルを備えた 2 チャネルポリジメチルシロキサン、PDMS、対流移動用体積交換装置、VECT デバイスを、前述のように準備しました 61,62。デバイスは、PBS 中の 1% BSA の不動態化バッファーを使用して空気と破片を除去するためにパージされ、気泡または詰まりが発生した場合のサイクルモニタリングのために Vista Vision (VWR) 顕微鏡のステージ上に置かれました。 New Era Pump Systems Model 300 シリンジポンプを使用して、流速 100 μL/min で細胞懸濁液を VECT 装置に通しました。得られたフロースルーを収集し、室温で 20 分間平衡化して、トランスフェクションを最大化し、細胞の回収を促進しました。細胞内 NMR 分光法のために、細胞を 200 g で 6 分間、25 °C で遠心分離し、5 mL PBS で 2 回洗浄しました。

炭素被覆銅顕微鏡グリッド (300 メッシュ、Electron Microscopy Sciences) を、Harrick プラズマクリーナー内で空気を使用して 30 秒間グロー放電させました。リポソームおよびリポソーム-mRNA 複合体を、5 μL の液滴で新たに排出したグリッドに適用し、空気への曝露と過剰乾燥を最小限に抑えるために、密閉した 15 cm 組織皿内で 5 分間吸着させました。サンプル溶液を４回再塗布した。 2% (w/v) 酢酸ウラニルを調製し、暗室のプラットフォームニューテーター上で一晩混合しました。 5 μL の 2% 酢酸ウラニルをグリッド上に直接堆積させて 1 分間グリッドを染色し、5 μL の超純蒸留水で 3 回洗浄しました。各ステップの間にワットマン紙で吸い取ることによって過剰な溶液を除去した63。

顕微鏡写真は、JEOL JEM-1400 透過型電子顕微鏡 (TEM) を使用し、80 kV の出力と XR401 電荷結合素子 (CCD) カメラ (AMT イメージング) を使用して撮影されました。画像は、30,000、40,000、および 80,000 の倍率で 780 ms の露光時間で撮影されました。プログラム Fiji (ImageJ ソフトウェア) を使用して、1094 個の粒子を含む合計 17 枚の画像を低、中、および高しきい値で処理しました。個々の粒子の面積は、Analyze Particles 機能を使用して測定されました。すべての粒子は自動的に選択され、画像の境界に直接ある粒子や互いに重なっている複数の粒子などの外れ値を除外するために手動でスクリーニングされました。

～ 10 × 107 細胞 (～ 500 μL) を、Krebs-Henseleit、KH、塩、50 mM HEPES、pH 7.2、118 mM NaCl、4.7 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1.2 mM と 1:1 (v/v) で混合しました。 MgCl2、および 2% アルギン酸塩を含む 3 mM NaH2PO4 (Sigma)。混合物を３ｍＬシリンジに移し、鈍い２１ゲージ針を備えた４０ｍｍのタイゴンチューブ（ＩＤ０．７９ｍｍ）に接続されたルアーロックチップを取り付けた。針は、150 mM CaCl2 を含む 25 mL ビーカーの表面に対して 45° に向けられました。シリンジポンプ（New Era Pump System NE-300）を使用して、細胞を300μL/minでアトマイザーに注入しました。アトマイザーは、5.5 L/分の空気流を備えた垂直方向のピペットで構成されていました。 CaCl2 溶液と接触すると、アルギン酸塩が重合して均一なサイズのビーズになり、細胞がカプセル化されました。 CaCl2溶液をデカントし、5mMグルコース、0.4mMパルミチン酸塩、0.4mM BSA、および70mU/Lのインスリンを補充した25mLのKH塩と置き換えた。次いで、ビーズをバイオリアクターに移した。

代謝データの収集に使用したバイオリアクターは、図 3a に示すように、以前に説明したものとほぼ同じでした 20。インジェクター (Rheodyne) を、5 mM 12C-グルコースを補充した新鮮な KH 塩を含む温めたリザーバーから 120 cm 離れた入口ラインに接続し、ポリエチレンチューブ (内径 1.19 mm、Clay Adams) で構築された 15 mL の注入ループを取り付けました。ループには 5 mM 13C-グルコースを補充した KH 塩が含まれており、標識培地への中断のない移行が可能でした。ビーズをキャストして NMR チューブに移した後、細胞を KH 培地中の 12C グルコースで平衡化し、ビーズを NMR チューブ内の最終位置に定着させ、導入前に代謝定常状態を確立しました。 13C-グルコース培地。細胞のエネルギーチャージを評価するために、標識培地の導入前と実験の終了時に 31 P スペクトルを収集しました。インジェクターバルブを切り替えて、標識媒体のパルスを開始した。標識された代謝産物は、標識されていない培地の連続的な流れによって追跡されました。フロースルーを 1.8 mL ずつ収集し、HSQC スペクトルを個別に取得することで細胞漏出と細胞からの代謝産物の輸出を評価しました。

すべての NMR スペクトルは、QCI-P 凍結プローブ (Bruker) を備えた 600 MHz Avance III NMR 分光計を使用して 300 K で記録されました。一次元の 13C 同位体編集 1H スペクトルは、13C 編集異核単一量子コヒーレンス (HSQC) 実験を使用した 32 回のスキャンで取得されました 43。 1H および 13C 次元のスペクトル幅はそれぞれ 16 および 80 ppm で、1H および 13C 次元ではそれぞれ 2048 および 1 ポイントでデジタル化されました。各過渡スペクトルの取得時間は 47 秒でした。各実験では、サンプル中に存在する代謝物のベースライン読み取り値を確立するために、13C 標識グルコースの注入前に 13C 同位体編集 1H スペクトルを収集しました。注射後、500 個のスペクトルが 5.5 時間にわたって連続的に収集され、13C-グルコースがさまざまな代謝経路を経て進行する際のその性質を監視できるようになりました。二次元の 13C-1H 相関スペクトルは、13C 編集された HSQC パルスプログラムを使用して 32 回のスキャンで取得されました 43。 1H および 13C 次元のスペクトル幅はそれぞれ 16 および 80 ppm で、1H および 13C 次元ではそれぞれ 2048 ポイントおよび 512 ポイントでデジタル化されました。

各試行の前に、細胞の代謝状態を評価できるように、プロトン分離 31 P スペクトルを 5 k スキャンと 1 秒のリサイクル遅延で収集しました。 31P スペクトルの中心は 242.935 MHz に相当する -10 ppm で、31P 次元のスペクトル幅は 30 ppm でした。 -11.5 ppm の 31P ピーク強度には、α-ATP、α-ADP、NAD+、および NAD(H) が含まれており、これらはすべて細胞の活力を評価するために使用できる重要な代謝産物です 20。すべてのスペクトルは、Topspin バージョン 3.2 (Bruker) で処理されました。

代謝研究では、1H-13C HSQC スペクトルを Topspin (v3.2、Bruker) および社内スクリプト (補足メソッド) を使用した MatLab を使用して処理しました。ピーク強度は I = (I/HEPES) – (Iref/HEPESref) として計算されました。ここで、I/HEPES はバックグラウンド Iref/HEPESref を差し引く前の正規化されたピーク強度を表し、HEPES は 3.08 ppm での HEPES のピーク強度です。一連の各 HSQC 実験の回数は、それぞれ 2.28、1.41、および 1.26 ppm のグルタミン酸、アラニン、および乳酸の対応する正規化強度で指標付けされました。これを GraphPad Prism にプロットして、各実験中の各代謝産物の 13C を添加した媒体パルス/ピークの X、Y 視覚化を作成しました。

各代謝産物パルスの強度の時間変化を分析しました。パルスの立ち上がりエッジと立ち下がりエッジの時間は、最適な適合を提供する指数回帰モデルから決定されました。 GraphPad Prism の 1 相結合モデルを使用して、パルスの先端で 13C グルコース強度をフィッティングしました。

単相減衰モデルを使用して後縁を適合させました。

ここで \({\mathrm{Y}}_{\mathrm{o}}\) は時間 0 におけるピークの初期強度、プラトーはピークの最大強度 (結合の場合) と最小 (減衰の場合) です。 K = 1/tRG または 1/ tFG はそれぞれ立ち上がりおよび立ち下がりの逆数の時定数で、t は時間 (秒) です。細胞内グルコース濃度約 0.5 mM64 は、KH 緩衝液中のグルコース濃度 (5 mM) の 10 倍低いため、全体のグルコース NMR シグナルに対する細胞内グルコースの寄与は無視できるほど小さいです。

乳酸、アラニン、およびグルタミン酸については、GraphPad Prism の 2 相結合モデルを使用して、パルスの前縁の強度をフィッティングしました。

ここで、K = 1/tP、代謝産物生成の逆数時定数、0 ≤ x ≤ 1 は、全体の当てはめに対する各指数成分のパーセンテージを割り当てるパラメーターです。式の ARo と AP に注意してください。 1 は、それぞれ x(プラトー –Yo) および (1-x)(Yo – プラトー) に対応します。 2 相減衰モデルを使用して後縁をフィッティングしました。

ここで、K = 1/tC、代謝産物クリアランスの逆数時定数。式の AFo と AC に注意してください。 2 は、それぞれ x (プラトー – Yo) および (1-x)(Yo – プラトー) に対応します。フィッティング結果に基づくと、(5) と (6) の x 値は無視できるほど小さいです (補足表 7)。

13C グルコースパルスの先端で、時間 t に伴う遊離 13C 標識代謝物 A* の濃度変化 (フラックス J および同位体定常状態濃度 A) は、標準的な速度フラックスプロファイリング (KFP) によって説明できます。、式65、66は、13Cグルコースパルスの非理想性を考慮し、代謝産物が大きすぎる受容体に共有結合または非共有結合している可能性を説明する現象学的項f1(A*,t)を追加することによって計算されます。 NMRで観察されるもの：

この方程式は、アラニンやグルタミン酸などの細胞内代謝産物の時間発展を表します。乳酸塩などの排泄された代謝産物の場合、バイオリアクターの NMR サンプリング容量 V が約 200 μL の希釈率 DR は F/V67 に等しくなります。ここで、F はバイオリアクターの流量が約 200 μL/min です。希釈時間 1/DR ～ 1 分は、標識代謝物の生成とクリアランスの特徴的な時間である tP および tC よりもはるかに短いです。したがって、細胞外代謝産物はアクティブボリュームからすぐに排出され、観察される NMR シグナルには寄与しません。

標識された代謝産物が、標識されていない対応物の存在下で遊離状態と結合状態の間で化学交換を受け、結合代謝産物の濃度が代謝産物の総濃度または結合部位の濃度よりもはるかに小さいと仮定すると、f1(A*, t) 項は 68 になります (式 (18) および (21) も参照):

ここで、K は特性結合パラメータ、α は特性結合率です。重要なのは、KA* exp(–αt) という項は時間が無限大になるとゼロに近づき、系が標識代謝物で平衡化されている場合には結合による正味の濃度変化が観察されないという事実を反映しています。この一次微分方程式の解は、式(1)を代入することで求めることができます。 (8) を式に代入します。（7）

積分係数 IF69 を使用

一般に、(9) の解は数値的にのみ可能です。ただし、代謝物の結合が非特異的であり、αt < < 1 の場合、IF の式は簡略化されます。この場合、式 (1) の解は次のようになります。 (10) は次のようになります。

ここで、yo1、AoR、およびA1は、13C-グルコースパルスの前縁（立ち上がり）における速度論的フラックスプロファイリングに適合するように決定された定数です。 tP = 1/(J/A + K) は、13C グルコースパルスの前縁に対する NMR 観察代謝物信号の立ち上がりの特徴的なタイムスケールであり、初期状態から次の状態に移行するのに必要な時間に数値的に対応することに注意してください。飽和レベルの 1/e ～ 0.63。重要なのは、tP は、標識代謝物の総濃度の変化の特性時間 tch = A/J65,66 よりも短いことです。この結果は、細胞内 NMR に基づくメタボロミクスにおいて、細胞内代謝産物の結合が KFP を調節することを裏付けています。

13C グルコースパルスの後縁では、遊離 13C 標識代謝産物 A* の濃度変化も、13C グルコースパルスの非理想性を考慮し、現象学的項 f2(A*, t) = KA* exp(–αt)

同じ条件 αt < < 1 が当てはまると仮定すると、式 (1) の解は次のようになります。 (10) は次のようになります。

ここで、yo2、AoF、および A2 は、13C グルコースパルスの後縁 (Fall) での運動束プロファイリングに適合するように決定された定数です。 NMR で観察された代謝産物シグナルにおけるクリアランスの特性時間、tC = 1/(J/AK) は tP より大きいことに注意してください。この場合、特性時間および結合パラメーター tch および K は、tch = 2/(1/tP + 1/tC) および K = (1/tP−1/tC)/2 として定義されます。この結果は、細胞内代謝物の結合が 13C グルコースパルスの信号の立ち上がりと立ち下がりに関して非対称な KFP を引き起こすこと、および細胞内 NMR が生細胞の代謝フラックスに対する代謝物の結合の寄与を定量できることを証明します。

濃度 [A] の非標識代謝物の存在下での濃度 [A*] の標識代謝物の競合結合モデルを使用して、遊離標識代謝物の濃度に対する結合の影響を説明しました 68。このシステムは 2 つの結合速度方程式によって記述されます。

そして

ここで、[A*R] と [AR] はそれぞれ結合標識代謝産物と未標識代謝産物の濃度、k1 と k2 はオン速度定数とオフ速度定数、[R] は遊離結合部位の濃度です。標識および非標識代謝産物と結合部位の合計濃度がそれぞれ [A]tot、[A*]tot、N である場合、[A*] = [A*]tot − [A*R], [A] = [A]tot – [AR] および [R] = N − [A*R] − [AR]。重要なのは、[A*]tot + [A]tot = [A]ss であり、[A]ss は同位体定常状態における代謝産物の濃度です。一般に、(14) と (15) は非線形微分方程式であり、数値的にのみ解くことができます。ただし、結合した代謝産物の濃度が総代謝産物濃度よりもはるかに小さい場合、式 (1) (14) と (15) は線形であり、正確に解くことができます68。解は初期条件に依存します

[A*R] t = 0 = 0 の場合、および

\(\left[ {{\text{A}}^{*} {\text{R}}} \right]_{{{\text{t }} = \, 0}} = {\text{ N k}}_{{1}} {\text{A}}^{*}_{{{\text{tot}}}} /\left( {{\text{k}}_{{1} } \left[ {\text{A}} \right]_{{{\text{ss}}}} + {\text{ k}}_{{2}} } \right)\)。

重要なのは、時間の経過に伴う結合代謝産物の濃度の変化は、(14) と (15) を微分し、結果を次のように表すことによって説明できることです。

ここで、K = N k1 および α = k1 [A]ss + k2 です。負の d[A*R]/dt は、式 1(A*, t) を定義します。 (7) 初期条件 [A*R]t = 0 = 0 に対応し、正の d[A*R]/dt は式 (7) の f2(A*, t) を定義します。 (12) であり、初期条件 [A*R]t = 0 = N k1 A*tot/(k1 [A]ss + k2) に対応します。

式 (14) と (15) は、結合代謝産物の濃度が結合部位の総濃度 N よりもはるかに小さい場合にも線形になります。この場合、解は初期条件にも依存します。

[A*R] t = 0 = 0 の場合、および

[A*R]t = 0 = N k1 A*tot/(k1 N + k2) の場合。重要なのは、時間の経過に伴う結合代謝産物の濃度の変化は、(19) と (20) を微分し、結果を次のように表すことによっても説明できることです。

ここで、K = N k1、および α = k1 N + k2 です。この場合、負の d[A*R]/dt は f1(A*, t) を定義し、初期条件 [A*R]t = 0 = 0 に対応し、正の d[A*R]/dt は f2( A*, t) であり、初期条件 [A*R]t = 0 = N k1 A*tot/(k1 N + k2) に対応します。 [A*R]t = 0 = N k1 A*tot/(k1 [A]ss + k2)。方程式の数値解 [AR] または [A*R] が [A]tot または [A*]tot に匹敵する一般的な場合の (14) および (15) を補足図 5 に示します。これらの方程式は、指数関数を使用して常に当てはめることができます。式のような関数。 (18) R2 係数が 0.99 よりも優れていることは、一般的な場合でも指数関数が適切な近似であることを示しています。

6 ウェルプレートに 2 mL の Opti-MEM/5% FBS 培地中の 3 × 105 HEK 293T 細胞を播種し、5% CO2 中で 37 °C で 20 時間インキュベートしました。 200 μL の OptiMEM 中の 10 μL の LF を最初のウェルに添加し、200 μL の OptiMEM 中の 5 μg の修飾ルシフェラーゼ mRNA と 10 μL の LF を 2 番目のウェルに添加しました。トランスフェクションは、増殖チャンバー内で 5% CO2、37 °C で 5 時間インキュベートされました。培地を２ｍＬの予め温めたＯｐｔｉＭＥＭ／５％ＦＢＳと交換し、細胞を増殖チャンバー内で２４時間回復させた（２８時間休止）。このプロセスをさらに 2 つのウェルに対して繰り返し、プレートを増殖チャンバー内で 4 時間インキュベートしました (4 時間休止)。 4 時間のインキュベーションが終了する前に、電子伝達複合体を阻害するアンチマイシン A を 1.5 μM の濃度で別のウェルに添加し、1 時間インキュベートしました。ウェルを温かいＯｐｔｉＭＥＭ／５％ＦＢＳで１回洗浄し、２ｍＬの同じ培地を補充した。上記のようにトリプシン-EDTAを用いて細胞をウェルから回収し、1.5 mLエッペンドルフチューブに移し、加温修飾PBS（1 mM MgCl2、1 mM CaCl2および5.5 mMグルコースを含むPBS）で2回洗浄しました。最後に、成長チャンバー内ですべてのウェルを修飾 PBS 中の 4 μM MitoSOX で 30 分間染色しました。細胞を300gで5分間遠心分離し、修飾PBSで2回洗浄し、再遠心分離した。細胞を80μLの修飾PBSに再懸濁し、黒色384wプレート(#784,086、Greiner Bio-One)の4つのウェルのそれぞれに10μLを等分した。プレートをSynergy H1プレートリーダー(BioTek)で510nmで励起し、580nmで発光させて読み取った。各細胞懸濁液 10 μL を 245 μL の PBS で希釈し、血球計を使用して手動で細胞数を数えました。

製造業者の指示に従って、直径１５ｍｍの円形ガラスカバースリップ（ＴｅｄＰｅｌｌａ）をＣｅｌｌ－Ｔａｋ溶液（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングした。 HEK 293T 細胞を増殖させ、以下の変更を加えた ROS プレートアッセイと同様に処理しました。細胞をトランスフェクトし、培地を更新し、28 時間または 4 時間休ませた後、Mito Tracker Deep Red FM を最終濃度 50 nM で添加してすべてのウェルを染色し、37 °C で 30 分間インキュベートしました。ウェルを PBS で洗浄し、細胞を 400 μL のトリプシン/EDTA で回収し、2 mL の OptiMEM/5%FBS で中和し、遠心分離し、修飾 PBS で 2 回洗浄し、エッペンドルフチューブ内で 4 μM を含む同じバッファーに再懸濁しました。ミトソックス。細胞を 37 °C で 10 分間インキュベートし、洗浄して 300 μL の修飾 PBS に再懸濁し、Cell-Tak 処理したカバースリップに添加して増殖チャンバー内で 20 分間貼り付けました。トランスフェクトされていない HEK 293T 細胞を含むウェルの 1 つを 1 μM のアンチマイシン A で処理しました。付着後、すべてのウェルをＰＢＳで２回洗浄した。 300 μL の 4% ホルムアルデヒドを加え、細胞を 37 °C で 10 分間固定しました。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３，２５８色素とともに室温で１０分間インキュベートした。カバースリップをＰＢＳで２回洗浄し、ＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＧ（ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してスライドガラス上に載せた。翌日、63 倍の対物レンズを備えた Zeiss LSM 710 レーザー走査型共焦点顕微鏡 (Carl Zeiss Microscopy) を使用して細胞を画像化し、ImageJ (米国国立衛生研究所、https://imagej.nih.gov/ij/) で分析しました。

平均分解パラメータ間の統計的有意性を確立するために、Prism (GraphPad) を使用して対応のない t 検定を実行しました。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。

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記載されているプロジェクトは、米国国立衛生研究所からの賞番号 1P01HL146367-01 および R01GM085006 によって支援されました。内容は著者のみの責任であり、必ずしも NIH の公式見解を表すものではありません。

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ニコラス・シオリーノ、セルゲイ・レベルダット、アーロン・プレモ、レナード・ブリンデル、ジャンチャオ・ユー、グレゴリー・セオファル、デヴィッド・S・バーツ、アレクサンダー・シェクトマン

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アンナ・リュー & トッド・スルチェック

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アン・マリー・シュミット & ラヴィチャンドラン・ラマサミー

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NS、DB、AMS、RR、AS が主な原稿テキストを書き、SR、AL、TS が図を作成しました。図 1 および 6、AP が作成図 2、NS、JY、および GT が作成図 3、NS が作成した図 4、5、および補足資料。著者全員が原稿をレビューしました。

アレクサンダー・シェクトマンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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Sciolino、N.、Reverdatto、S.、Premo、A. 他。脂質ナノ粒子中のメッセンジャー RNA は、リアルタイムパルスチェイス NMR、RTPC-NMR、分光法で研究されたように、脂質誘発性ミトコンドリア機能不全から HEK 293 細胞を救います。 Sci Rep 12、22293 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-26444-z

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受信日: 2022 年 8 月 22 日

受理日: 2022 年 12 月 14 日

公開日: 2022 年 12 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26444-z

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