宿主を研究するためのCOPDオルガノイドの確立 | 北京アジャイルリフトベンチャーズグループ株式会社

Nature Communications volume 13、記事番号: 7635 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

慢性閉塞性肺疾患（COPD）は気流制限と感染性増悪を特徴としていますが、個体レベルでの宿主と病原体の相互作用を研究するためのインビトロモデルシステムが不足しています。ここでは、健康な個人と COPD から疾患を個人レベルで再現する鼻咽頭および気管支オルガノイドの樹立について説明します。健康なオルガノイドとは対照的に、COPDオルガノイドでは杯細胞過形成と毛様体拍動頻度の低下が観察され、これはこの疾患の顕著な特徴である。単細胞トランスクリプトミクスにより、COPD オルガノイドにおける細胞分化軌道の変化の証拠が明らかになりました。 COPDオルガノイドのSARS-CoV-2感染により、重篤な新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の重要な感染部位である気管支でのより生産的な複製が明らかになった。オルガノイドのウイルスおよび細菌への曝露は、COPDオルガノイドにおいてより大きな炎症促進反応を誘発しました。要約すると、我々は、in vivo の生理学的肺微小環境を個人レベルで再現し、宿主と病原体の相互作用や新興感染症の研究に適したオルガノイドモデルを提示します。

慢性閉塞性肺疾患（COPD）は、世界的に罹患率と死亡率が高い慢性炎症性呼吸器疾患です1。この疾患は、進行性の不可逆的な気流制限の発症、不均一な内部表現型、および個々の患者間の異なる疾患の軌跡を特徴としています2、3。患者は持続的かつ進行性の呼吸器症状、肺機能障害、肺の構造的異常および増悪に苦しんでいます4。また、COPD 患者は心血管疾患などの併存疾患の有病率が高く、これが臨床転帰の悪化や死亡リスクの上昇につながります5。 COPD の複雑さと個々の患者間の不均一性は現在広く認識されているが、この疾患を個人レベルで再現する適切な実験モデルが不足しているため、細胞ベースの研究は依然として非常に困難である6,7。マウス、モルモット、ウサギなどの小動物モデルはすべて COPD の研究に使用されていますが、これらはヒト疾患の遺伝学とエピジェネティクスを再現することができず、COPD を誘発する必要があり、一度確立されると、観察されたエンド表現型の臨床スペクトル全体を必ずしも模倣するとは限りません。個々の患者では8、9。したがって、このような制限を克服し、個人差を考慮した次世代細胞モデルを確立することは、COPDにおける個人レベルでの感染と治療反応を支える分子機構をより深く理解し、ベンチベースの精密医療の適用を可能にするために重要である。

このような個人化された研究を促進するには、個人レベルで COPD の気道微小環境を再現する、容易にアクセスできる in vitro モデルを開発することが最も重要です。現在までのところ、COPD における宿主と病原体の相互作用を研究するための適切な実験モデルは依然として不足しています。過去 10 年間で、3 次元構造内に複数の細胞型を組み込んだ幹細胞由来オルガノイドの生成が大きく進歩しました 10。オルガノイドは、それぞれの臓器の組織固有の機能的特徴を再現し、宿主と病原体の相互作用の研究を促進するための実験ツールです。それぞれの解剖学的領域の上皮組織を再現するヒト肺オルガノイドモデルは、出発材料として成体または多能性幹細胞を使用して、鼻11,12、気管支13および肺胞組織14,15から生成することに成功している16,17,18。肺オルガノイドは、肺がん 13,19 や嚢胞性線維症 13 の研究、呼吸器合胞体ウイルス (RSV) 13、エンテロウイルス 20、クリプトスポリジウム 21、インフルエンザ 22,23、そして最近では重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) などの感染症の評価に使用されています。 24、25、26。臨床データおよび疫学データは、COPD が入院や死亡の高いリスクを含む重度の COVID-19 転帰と関連していることを示していますが、その原因となるメカニズムは欠如しています 27,28,29,30,31,32,33,34。

ウイルス感染以外では、細菌感染が COPD の増悪のかなりの部分を占めており、主に分離される種としては、肺炎球菌や緑膿菌が挙げられます 35。

ここでは、COPD肺オルガノイドの確立と特性評価を示し、これらをSARS-CoV-2や緑膿菌などの宿主と病原体の相互作用の研究に応用します。当社の COPD オルガノイドモデルは、生体内での生理学的肺微小環境を再現し、ウイルスおよび細菌感染に対する炎症反応の亢進を引き起こします。

初代ヒト鼻咽頭オルガノイドおよび気管支オルガノイド（それぞれNPOおよびBO）は、修正を加えて以前に報告された方法によって樹立されました（図1a）13。よく分化した気道オルガノイドは、棍棒細胞、杯細胞、および繊毛細胞で裏打ちされた単一または場合によっては複数の管腔を発達させます。基底細胞は外側に位置し、粘液の渦巻きを促進する運動性繊毛が内側に向かって視覚化されました（図1b、c、補足図1および補足ビデオ1）。非罹患オルガノイドの免疫蛍光染色により、腫瘍タンパク質 63 (TP63) + 基底細胞、セクレトグロビンファミリー 1 A メンバー 1 (SCGB1A1) + クラブ細胞、アセチル化 α-チューブリン (Ac-チューブリン) + 繊毛細胞およびムチン 5AC の細胞マーカーが示されました。 (MUC5AC) + NPO と BO の両方の杯細胞 (図 1b、c、補足図 1)。 NPOとBOの間に顕著な違いが観察され、特にBOは広範なAc-チューブリン+繊毛構造とより高いFOXJ1遺伝子発現を備えたより繊毛性が高かった（図1b、c、補足図1）。定量的PCR（qPCR）により、BOはNPOと比較して有意に高いTP63、SCGB1A1、およびFOXJ1を発現していることが確認されましたが、NPOとBOの間で同様のMUC5AC発現が検出されました（図1d–g）。

a 初代ヒト鼻咽頭および気管支上皮細胞の単離とヒトオルガノイドの生成の概略図。 b ヒト鼻咽頭オルガノイド（NPO）（上気道）のTP63（基底細胞：緑色）、SCGB1A1（クラブ細胞：紫）、アセチル化α-チューブリン（Ac-チューブリン）（繊毛細胞：緑色）およびMUC5ACの免疫蛍光染色（杯細胞：紫）。核と F-アクチンはそれぞれ DAPI (青) とファロイジン (赤/白) で対比染色されます。スケールバー = 20 μm。 c. ヒト気管支オルガノイド (BO) (下気道) の免疫蛍光染色。スケールバー = 20 μm。 bc のデータは、少なくとも 5 つの独立した実験の代表です。 d – g（D）TP63（基底細胞）、（E）SCGB1A1（クラブ細胞）、（F）FOXJ1（繊毛細胞）および（G）MUC5AC（杯細胞）についてNPOおよびBOから抽出した全RNAのqRT-PCR分析）。 NPO と BO のそれぞれ n = 7 と n = 3 の生物学的に独立した実験が示されています。データは中央値±四分位範囲として表示され、マン-ホイットニー U 検定が実行されます。 *P < 0.05 [TP63 = 0.0333; SCGB1A1 = 0.0238; FOXJ1 = 0.0238]。 HNPEC: ヒト鼻咽頭上皮細胞。 BALF: 気管支肺胞洗浄液。 HBEC: ヒト気管支上皮細胞。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

COPD被験者に由来するNPOおよびBO（GOLDステージB、CおよびD）には、非罹患オルガノイドで観察されるすべての細胞型が含まれています（図2a、b、補足図1）。非罹患NPOと比較してCOPDにおけるMUC5AC遺伝子発現の大幅な上昇など、杯細胞の豊富さがCOPDオルガノイドの特徴でした（図2a〜c）。 COPD BOでは、棍棒細胞および繊毛細胞集団の減少が明らかであり、この疾患状態の特徴でした（補足図1、2b、c）。 COPDオルガノイドをドナーの増悪によって層別化した場合、増悪頻度の増加は、それぞれのオルガノイド培養におけるMUC5AC遺伝子発現の増加と有意に関連していました（図2d）。肺機能との密接な関係が観察され、肺機能が最も低い人（予測 FEV1 % が 30% 未満）が最も高い MUC5AC 遺伝子発現を示し、MUC5AC 遺伝子発現と予測 FEV1 % との有意な逆関係によってさらに例示されます（R = − 0.5890; p = 0.0008; 図 2e、f)。重要なことに、臨床的COPD相関とのこの細胞の関連性は、オルガノイドモデルに存在する他の細胞型には拡張されません（補足図2）。 COPD は、感染の素因となる粘液線毛クリアランスの障害を示し、そのような機能不全の存在は、誘導された非罹患 BO および COPD BO において、マイクロ光コヒーレンストモグラフィー (μOCT) イメージングによって評価されました。 BO は機能的な繊毛の明確な視覚化を示し、繊毛拍動周波数（CBF）は、非罹患者と比較した場合、COPD BO では有意に低かった（図 2g、h および補足ビデオ 2）。

a ヒト鼻咽頭オルガノイド (NPO) の免疫蛍光染色、および b 非罹患者 (左) および COPD 患者 (右) に由来するヒト気管支オルガノイド (BO) の MUC5AC (紫色) の染色。上のパネルはオルガノイドの外側を示し、下のパネルはオルガノイドの内腔を示します。スケールバー = 20μm。 a-b のデータは、少なくとも 5 つの独立した実験の代表です。 c MUC5ACに関する非罹患者（ND）およびCOPD患者に由来するNPOおよびBOから抽出された総RNAのqRT-PCR分析。 GOLD ステージ B、C、D の ND と COPD は、それぞれ黒、青、黄、緑の記号で示されます。 n = 7; n = 10; NPO-ND については、n = 3 および n = 8 の生物学的に独立した実験。 NPO-COPD; BO-NDとBO-COPDが図示されています。データは中央値±四分位範囲として示され、マンホイットニー U 検定が実行されました。 ***P < 0.001。 [NPO-ND vs NPO-COPD = 0.0004] d ND および COPD に由来する NPO および BO における MUC5AC 遺伝子発現。後者は増悪頻度によって非増悪者 (NE) として階層化されている。増悪因子（E）と高頻度増悪因子（FE）。 n = 28 の生物学的に独立したサンプルが示されています。データは中央値±四分位範囲として表示され、マン-ホイットニー U 検定が実行されます。 *P < 0.05; ****P < 0.0001。 [ND 対 NE = 0.0117; ND 対 E < 0.0001; ND 対 FE < 0.0001]。 e 予測される第 1 秒パーセントの努力呼気量としての肺機能 (FEV1 % 予測)。 n = 28 の生物学的に独立したサンプルが示されています。データは中央値±四分位範囲として示され、マンホイットニー U 検定が実行されました。 ***P < 0.001; **** P < 0.0001。 [ND vs 50–79%=0.0003; ND 対 30 ～ 49% <0.0001; ND 対 <30% <0.0001]。 f FEV1%予測に基づくCOPDオルガノイドにおけるMUC5AC遺伝子発現を相関させる散布図。 n = 28 の生物学的に独立したサンプルが示されています。スピアマンの相関係数 (ノンパラメトリック) 分析を実行しました。 P = 0.0008。 g NDおよびCOPDの気管支オルガノイドのマイクロ光コヒーレンストモグラフィー（μOCT）イメージングを使用して0および14秒（秒）でキャプチャされた代表的な画像。スケールバー = 50 μm。 g のデータは 3 つの独立した実験の代表です。 h ND (n = 3) および COPD (n = 3) に由来する気管支オルガノイドの毛様体拍動周波数 (CBF) 測定値をヘルツ (Hz) で定量化します。 CBFを決定するために、画像シーケンスごとに毛様体の活動の最大10領域でドナーごとに6〜10のオルガノイドが評価されます。データは中央値±四分位範囲として表示され、マン-ホイットニー U 検定が実行されます。 ***P < 0.001 [P = 0.0008]。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

単細胞トランスクリプトームは、私たちの in vitro 肺オルガノイドが、周期基底細胞、基底細胞、クラブ細胞、杯細胞、繊毛上皮細胞など、ネイティブの in vivo 気道に見られる主要な細胞集団を忠実に再現していることを示しています（図 3a、補足図 3a）。）NPOとBOの両方で（補足図3c、d）。サンプルサイズは小さいですが、この結果は、図示されているように、免疫蛍光および qPCR 分析と一致しています (図 1、2)。細胞の同一性は、Garcia et al. に由来する気道および肺細胞の特徴的な遺伝子セットに基づいて注釈が付けられました。（2019）およびTravaglini et al。 (2020) それぞれの細胞クラスターのマーカー遺伝子を使用します 36,37 (補足データ 1)。さらに、特定のマーカー遺伝子、たとえば、周期基底細胞の場合はMKI67、基底細胞の場合はTP63およびKRT5、クラブ細胞の場合はSCGB1A1、杯細胞の場合はMUC5AC、繊毛上皮細胞の場合はFOXJ1を使用して細胞の同一性を確認しました（補足図3b）。全細胞の約 1.4% を含む単一の小さなクラスターが検出され、KRT5 発現のみが示されたため、これらを保守的に「上皮細胞」として分類しました。非罹患オルガノイドと比較すると、COPDオルガノイドでは、周期的基底細胞(5.4%対16.0%)および繊毛上皮細胞(3.2%対5.2%)が少ないが、基底細胞(45.7%対35.6%)および杯細胞(15.9%対11.5%)が多かった。 %)。クラブ細胞集団は同等でした（29.4％対29.3％）（図3b）。杯細胞の存在量が多く、繊毛細胞の割合が低いことは、COPD に特徴的な杯細胞過形成と繊毛異常を示しています。

scRNA-seq トランスクリプトームデータの UMAP プロットは、非疾患 (ND) (左; n = 8614 細胞) (1 つの NPO-ND 系統と 1 つの BO-ND 系統のプール) および COPD の肺オルガノイドで検出された主な細胞タイプを強調表示します。 (右; n = 11,263 細胞) (1 つの NPO-COPD 系統と 1 つの BO-COPD 系統のプール)。 b NDおよびCOPDオルガノイドにおける9つの主要な細胞型の相対存在量を示す積み上げ棒プロット。 c ND（上）およびCOPDオルガノイド（下）の擬時間解析。繊毛細胞および杯細胞系統への周期的基底細胞の可変軌道を示しています。 d NDおよびCOPDオルガノイドにおける、細胞型特異的マーカーに基づいた発現パターンの変化を示すヒートマップ。細胞は、それぞれの疾患状態 (ND または COPD、細胞タイプ、擬似時間) ごとに並べられ、提供されるカラーキーによって発現レベルによって示されます。 e 基底細胞、クラブ細胞、および杯細胞のそれぞれについて、COPDの差次的に発現した遺伝子からNDオルガノイドに由来する、上位に濃縮されたIngenuity Pathway Analysis（IPA）標準経路を示す棒グラフ。 IPA からの予測活性 Z スコアは色分けされています (赤: 活性化、青: 阻害、灰色: 利用可能な活性パターンなし)。

次に、COPD の小気道に由来する公的に利用可能なバルク RNAseq データセット (GSE162154) を評価し、DEG の発現プロファイルを scRNAseq データの疑似バルク解析で観察されたプロファイルと比較しました。階層的クラスタリングにより、健康なサンプルと COPD サンプルの異なるクラスターが明らかになります。ミトコンドリア機能不全、小胞体ストレス、繊毛再構成、細胞外マトリックスリモデリング、炎症誘発性サイトカインシグナル伝達など、COPDオルガノイドで検出された主要な機能経路は、疑似バルク解析と公開データセットの両方に共通でした（補足図4b、c）。 COPDオルガノイドからの基底細胞は、他の細胞型では観察されない非常に一貫した機能パターンを示し、繊毛細胞および杯細胞系統への循環基底細胞の変化した発生軌道を示します（図3c）。気道およびオルガノイドに基底細胞が大量に存在すると、バルク RNAseq 解析で他の細胞タイプが過小評価される可能性があります。これは、肺オルガノイドからの基底細胞トランスクリプトームと公的にアクセス可能なバルクRNAseq COPDデータセットの間で観察された機能的類似性に反映されています（補足図4c）。

COPDオルガノイドにおいてトランスクリプトームを単一細胞解像度で捕捉すると、バルクRNAseqでは認識できない、マイナーな細胞タイプに関連する機能変化の評価が可能になります。基底細胞、クラブ細胞、および杯細胞のそれぞれ 2 つのサブ集団が、非罹患オルガノイドと COPD オルガノイドの間で存在量が大きく異なることが同定されました。ここで、COPD オルガノイドは以下のグループによって過剰に表されます: 基底細胞 2 (35.3% 対 4.7%)、クラブ細胞細胞2（15.6％対1.2％）および杯細胞2（10.4％対0.7％）、いずれも非罹患オルガノイドでは観察されません（図3b〜d）。基底細胞 2 グループとクラブ細胞 2 グループは、COPD オルガノイドにおける基底細胞の発生軌道の変化で観察される主要な中間細胞タイプも表します (図 3b-d)。 COPDオルガノイドは、非疾患オルガノイドと比較した場合、ある細胞型から別の細胞型への移行障害を示します（図3c、d）。これは、基底細胞 2、クラブ細胞 2、および杯細胞 2 におけるマーカー遺伝子発現の明らかな喪失によって証明されており、これらはすべて COPD オルガノイドで過剰に発現しており、他の細胞型からのマーカー遺伝子の発現は検出可能である（図 3b–d、図 3b–d、補足図3d、4a)。総合すると、これはおそらく COPD の病因に起因する、COPD オルガノイドからの細胞の断続的な分化を示唆しています。

非罹患オルガノイドとCOPDオルガノイドの間で異なる機能経路をさらに調査するために、各オルガノイドモデルの基底細胞、クラブ細胞、および杯細胞間の機能の違いを評価しました。 COPDオルガノイドの3つの細胞型はすべて、同様の標準経路の摂動を示しています（図3e）。基底細胞およびクラブ細胞では、EIF2 経路と酸化的リン酸化が顕著に活性化されましたが、サーチュインシグナル伝達は軽度に抑制されました。杯細胞では逆の傾向が観察されました。独立して、遺伝子セット濃縮分析（GSEA）は同様の障害を捕捉しましたが、さらに3つの気道細胞タイプすべてで免疫細胞の活性化も明らかにしました（補足図4d）。

私たちが作成したヒト肺オルガノイドは、宿主と病原体の相互作用の研究に適しています。このような感染研究を促進し、感染微生物の管腔細胞集団への直接アクセスを可能にするために、NPOとBOは頂端外極性を達成するように再配向されました（図4a、b）。外側に向いた繊毛を持つオルガノイドは懸濁液中で 72 時間以内に分化し、基底細胞は目に見える内腔のないオルガノイド内部に位置しました。機能的に有能な繊毛は現在外側を向いており、オルガノイド構造全体の自己回転を誘発します（補足ビデオ3）。

a NPO および BO の SARS-CoV-2 感染に関する方法論的ワークフローを概説する概略図。 b「基底アウト」および「頂端アウト」気道オルガノイド（上）の図表示と、TP63（基底細胞：赤色）およびAcチューブリンの「基底アウト」および「頂端アウト」極性でのNPOの免疫蛍光染色（繊毛細胞：緑色）（下）。スケールバー = 20 μm。 c ACE2 に対する非罹患個人由来の NPO および BO の免疫蛍光染色 (緑色)。スケールバー = 20 μm。 bc のデータは、少なくとも 5 つの独立した実験の代表です。 d – e TCID50アッセイによる、感染後1、24、48、72および96時間（hpi）でのSARS-CoV-2感染（d）NPOおよび（e）BOから採取した培養上清からのウイルス複製動態。 n = 4 および n = 3 は、それぞれ NPO および BO に対する生物学的に独立した実験です。データは平均値 ± SEM として表示され、一元配置分散分析が実行されます。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 [NPO: 48 hpi: L-WU 対 O-614D = 0.0005; G-614G 対 O-614D = 0.0002; 72 hpi: L-WU 対 O-614D = 0.0170; G-614G 対 O-614D = 0.0006; 96 hpi: L-WU 対 G-614G = 0.0041; G-614G 対 O-614D = 0.0011; BO: 24 hpi: L-WU 対 O-614D = 0.0070; G-614G 対 O-614D = 0.0065; 48 hpi: G-614G 対 O-614D = 0.0048]。 f – g SARS-CoV-2に感染した（f）NPOおよび（g）BOからそれぞれ48および72 hpiで抽出された総RNAのインターロイキン-6（IL-6）、インターフェロン-β（IFN-β）のqRT-PCR 、CXCモチーフケモカインリガンド10(CXCL10)および腫瘍壊死因子-α(ΤNF-α)。 n = 3 の生物学的に独立した実験が示されています。データは平均値 ± SEM として表示され、一元配置分散分析が実行されます。 *P < 0.05; **P < 0.01。 [NPO: IFN-β: MK vs G-614G = 0.0399; G-614G 対 O-614D = 0.0484; CXCL10: 48hpi: MK 対 L-WU = 0.0156; 72hpi: MK 対 L-WU = 0.0259; MK 対 G-614G = 0.0018; G-614G 対 O-614D = 0.0017; L-WU 対 O-614D = 0.0236; ΤNF-α: 48hpi: MK 対 G-614G = 0.0254;L-WU 対 G-614G = 0.0069; G-614G 対 O-614D = 0.0098; 72hpi: MK 対 G-614G = 0.0374;L-WU 対 G-614G = 0.0062] [BO: IL-6: MK 対 G-614G = 0.0054; L-WU 対 G-614G = 0.0282; G-614G 対 O-614D = 0.0066; IFN-β: MK 対 G-614G = 0.0055; L-WU 対 G-614G = 0.0185; G-614G vs O-614D = 0.0092]L-WU: クレード L-武漢株。 G-614G：クレードG株、O-614D：クレードO株。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

非罹患者およびCOPDからのNPOおよびBOは、ACE2、TMPRSS2、フリン、ニューロピリン-1を発現しており、これらはすべてSARS-CoV-2感染において重要な役割を果たしています（補足図5a〜d）。注目すべきことに、ACE2、TMPRSS2、およびニューロピリン-1の遺伝子発現は、非罹患ドナーの下気道で有意に高く、COPDでは上気道と下気道の間に差はありませんでした（補足図5a〜d）。 ACE2は、極性とは無関係で、細胞の種類や分布とは無関係に、NPOおよびBOで検出されました（図4c）。我々の単一細胞分析により、ACE2がいくつかの細胞型で発現されており、TMPRSS2がほとんどの細胞型、特に繊毛上皮細胞に浸透している一方、フリンは主にニューロピリン-1と共局在していることが明らかになりました（補足図6）。興味深いことに、COPD-NPOは非罹患者と比較してより高いACE2およびTMPRSS2発現を示しましたが、COPD-BOでは対照的なパターンが観察されました（補足図5a、b、6）。

COPDの増悪頻度の増加と、4つのSARS-CoV-2因子すべての遺伝子発現の増加との間に有意な関係が検出されました（補足図5e-h）。肺機能を考慮すると、肺機能が最も劣る COPD では TMPRSS2、フリン、ニューロピリン-1 の有意に高い発現が観察され (予測 FEV1 % が 30% 未満)、フリンのみが予測 FEV1 % (R) と有意な逆相関を示しました。 = − 0.4880; p = 0.0072）（補足図5i–p）。

SARS-CoV-2 ゲノムの自然突然変異は、パンデミック期間中継続的に獲得され、ウイルスの適応度を変化させます。したがって、我々は、異なる病因を評価するために、クレード L の祖先武漢株 (L-WU、GISAID アクセッション ID: EPI_ISL_407987)、クレード O 株 (O-614D、GISAID アクセッション ID: EPI_ISL_574486) の 3 つの患者分離株を選択しました。クレード G 株 (G-614G、GISAID アクセッション ID: EPI_ISL_574489)。スパイクタンパク質-D614G、ORF1abでアミノ酸の変化が確認され、G-614GとL-WUの間のNS6で検出された終止コドンが検出されましたが、O-614DではORF1ab、S、NS7a、およびNのさらなる変異が検出されました（補足）表1）。 SARS-CoV-2感染は、96時間の感染期間にわたってNPOにおいて細胞変性効果を誘発しませんでした（補足図7）。感染後48時間および72時間（hpi）で測定されたqPCRによって評価されたウイルス感染性は、3つの分離株間または上気道と下気道の間に有意な差がないことを示しました（補足図8a-c）。 L-WUおよびG-614GはNPOおよびBOで生産的に複製されましたが、O-614DはVero-E6細胞で実証された生産的複製にもかかわらず複製できませんでした（図4d、e、補足図8d〜fおよび10）。上気道の代表であり、SARS-CoV-2伝播の重要な部位であるNPOでは、G-614Gは96 hpiでL-WUと比較して有意に高い力価まで複製し、168 hpiまで延長した（図4d、補足図8g）。）。さらに、G-614G に感染したオルガノイドは、インターフェロン β (IFN-β)、CXC モチーフケモカインリガンド 10 (CXCL10)、および腫瘍壊死因子 α (ΤNF-α) 遺伝子発現の増強を特徴とする 72 hpi で炎症誘発性免疫応答の増強を誘発します。 NPO と BO のインターロイキン-6 (IL-6) および IFN-β それぞれ (図 4f、g)。 NPOおよびBOのG-614G感染は、72 hpiでCXCL10を大幅に増加させます（補足図8hおよび9）。

臨床データと疫学データは、COPD が重症の COVID-1934 の独立した危険因子であることを示唆しています。したがって、我々は次に、これらの臨床所見と細胞の相関関係を解明するために、気道オルガノイドにおける感染力、ウイルス複製、炎症誘発性および抗ウイルス反応を評価しました。研究は、L-WU および G-614G 株の感染に基づいていましたが、O-614D は非罹患モデルで複製および炎症反応の誘導に失敗したため、O-614D には基づいていませんでした。非罹患状態に匹敵する高レベルのSARS-CoV-2感染力が、48および72 hpiに上気道および下気道からのCOPDオルガノイドで検出された（補足図11）。興味深いことに、ウイルス複製動態により、NPOではL-WUの複製効率が低いことが明らかになりましたが、COPD患者に由来するBOでは複製の増強が観察されました（図5a、b）。 COPDと非罹患NPOの間でG-614G変異体の差異は観察されなかったが、前者では下気道（すなわちBO）における複製の有意な増強が再び明らかであった（図5c、d）。注目すべきことに、細胞溶解物（ヌクレオカプシド（NS）遺伝子発現の検出）と培養上清（生きた感染性ウイルスの検出）がそれぞれqPCR実験とTCID50実験で使用され、測定されたウイルス量とウイルス力価の間で観察された差異が説明されました。しかし、総合すると、これは、G-614Gの複製能力が全体的に強化されていること、そして重要なことに、重篤なCOVID-1934の発症の主な部位であるCOPD気管支におけるウイルス複製の可能性が大幅に増加して強力であることを示唆しています（図5c、d））。 IL-6、IFN-β、およびCXCL10のqPCR評価では、COPDを伴うL-WU感染後とCOPDを伴わないL-WU感染後のNPOとBOの間に差がないことが明らかになった。ただし、G-614G に感染すると、非罹患者と比較した場合、COPD 下部気道における IL-6 および IFN-β の大幅な減少が示され、CXCL10 の阻害傾向が見られました（図 5e-h）。

a – d TCID50アッセイによる、1、24、48、72、および96 hpiのL-WU感染およびG-614G感染NPOおよびBOからのウイルス複製動態。 NPO および BO 感染に対する n = 3 の生物学的に独立した実験が示されています。データは平均値 ± SEM として表示され、対応のない t 検定が実行されます。 *P < 0.05; ***P < 0.001。 [NPO L-WU: 24 hpi=0.0494; 72 hpi=0.0004; BO L-WU: 24 hpi=0.0110; 96 hpi=0.0152; BO G-614G: 24 hpi=0.0294; 96 hpi=0.0457]。 e-h IL-6、IFN-β、およびCXCL10について、それぞれ非罹患者およびCOPD患者に由来するL-WU感染およびG-614G感染NPOおよびBOから72 hpiで抽出された総RNAのqRT-PCR分析。 n = 3 の生物学的に独立した実験が示されています。データは平均値 ± SEM として表示され、対応のない t 検定が実行されます。 *P < 0.05。 [イチジク。 5時間: IL-6 = 0.0237; IFN-β = 0.0248] ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

COPD の臨床経過は、増悪と呼ばれる臨床的悪化のエピソードによって中断されます。細菌感染はそのような増悪の一部を占めており、ここではCOPD患者からの「アピカルアウト」NPOを使用して、緑膿菌と肺炎球菌による炎症の転帰を調査しました（図6および補足図11）。非疾患NPOとCOPD NPOはどちらの細菌による感染にも比較的感受性が高く、COPD NPOは細菌感染に対するRNAおよびタンパク質レベルでのより大きな炎症誘発反応を誘導し、感染に対する宿主反応の評価におけるCOPDオルガノイドモデルの価値を実証しました（図6b-） dおよび補足図11）。緑膿菌に感染した COPD NPO のバルクトランスクリプトームプロファイリングでは、非感染状態では非罹患 NPO と比較して、繊毛運動が著しく障害され、分泌および細胞外マトリックスのリモデリング活動が増加していることが示されています。予想通り、罹患していないNPOの緑膿菌感染は、サイトカイン産生とシグナル伝達の上昇を伴う急性炎症を引き起こした(図6e、f)。注目すべきことに、感染したCOPD NPOでは炎症反応とストレス反応が大幅に増強されました。

a NPOの細菌感染方法の概略図。 b 緑膿菌 16 S 遺伝子について、6 hpi で非罹患者および COPD 患者に由来する緑膿菌感染 NPO から抽出された総 RNA の qRT-PCR 分析。 n = 4 および n = 6 の生物学的に独立した実験が、ND および COPD に対してそれぞれ実行されました。データは平均値±SEMとして表示されます。 c C-Cモチーフケモカインリガンド2（CCL2）、CCL5、CXCモチーフケモカインリガンド10（CXCL10）、腫瘍壊死因子-α（ΤNF-α）、インターロイキンについての6 hpiでの緑膿菌感染NPOのqRT-PCR分析-1β (IL-1β)、IL-6、IL-8。 NDの場合はn = 4、COPDの場合はn = 6。データは平均値 ± SEM として表示され、対応のない t 検定が実行されます。 *P < 0.05 [CCL2 = 0.0188; CXCL10 = 0.0239; IL-6 = 0.0470]。 d CCL2、CCL4、CXCL10、TNF-β、インターフェロン-γ (IFN-γ)、IL-6、IL-8、IL-9、増殖関連癌遺伝子-α (GRO-α) および顆粒球コロニー刺激因子 (マルチプレックス Luminex アッセイによる 6 hpi での NPO における緑膿菌感染時の G-CSF) 放出。 NDの場合はn = 5、COPDの場合はn = 6。データは平均値 ± SEM として表示され、対応のない t 検定が実行されます。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; **** P < 0.0001。 [CCL2: COPD-MK 対 COPD-PAO1 = 0.0039; ND-PAO1 対 COPD-PAO1 = 0.0062、CCL4: ND-MK 対 ND-PAO1 = 0.0190; COPD-MK 対 COPD-PAO1 = 0.0040; CXCL10: ND-PAO1 = 0.0014; COPD-MK 対 COPD-PAO1 = 0.0217; TNF-β: ND-MK 対 ND-PAO1 = 0.0333; COPD-MK 対 COPD-PAO1 = 0.0096; IFN-γ: ND-MK 対 ND-PAO = 0.0114; ND-PAO1 対 COPD-PAO1 = 0.0002; IL-6: ND-PAO1 対 COPD-PAO1 = 0.0238; COPD-MK 対 COPD-PAO1 = 0.0055; IL-8: COPD-MK 対 COPD-PAO1 = 0.0099; IL-9: COPD-MK 対 COPD-PAO1 < 0.0001; GRO-α: ND-MK 対 ND-PAO1 = 0.0062; COPD-MK 対 COPD-PAO1 = 0.0018; G-CSF: ND-MK 対 ND-PAO1 = 0.0004; COPD-MK 対 COPD-PAO1 = 0.0005; ND = PAO1 対 COPD-PAO1 = 0.0067]。 e 疑似処理または緑膿菌に6時間感染させたNDおよびCOPD NPOトランスクリプトームの主成分分析（PCA）（グループあたりn = 3）。 f それぞれNDおよびCOPDの緑膿菌感染NPOと非感染NPOの間で差次的に発現される遺伝子（2561遺伝子）のヒートマップ。発現プロファイルに基づいて 5 つの主要な遺伝子クラスターが特定され、生物学的機能に注釈が付けられています。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

ここでは、宿主と病原体の相互作用を研究するために成体幹細胞に由来する COPD オルガノイドの確立と特性評価を示します。 COPD オルガノイドは多細胞の 3 次元回転楕円体構造であり、COPD の必須の細胞特性を示します。 COPDオルガノイドは、それぞれのドナーの基礎疾患の重症度に関連し、予想される疾患病理を代表する杯細胞過形成と毛様体拍動頻度の低下を示します。 COPDオルガノイドの単細胞分析により、疾患状態を代表する発生異常と機能異常が明らかになりました。 COPDオルガノイドのSARS-CoV-2感染は、健康な人と比較して気管支でのより生産的な複製を明らかにし、COPDにおける新型コロナウイルス感染症の転帰が不良であるという臨床観察の潜在的な根拠を提供する。

慢性的、再発性の気道損傷および炎症に反応する気道リモデリングは、COPD を含む慢性呼吸器疾患の重要な病理学的特徴です 38,39,40。さらに、粘液過剰分泌と大量の杯細胞は COPD 気道の特徴であり、気道閉塞、粘液線毛クリアランス障害、および増悪を促進します 41、42、43、44。 COPDオルガノイドは、この杯細胞過形成の表現型を再現しており、健康な人と比較してMUC5AC遺伝子発現が高く、毛様体拍動頻度が低下しています。興味深いことに、オルガノイドにおけるMUC5AC遺伝子発現は、COPDドナーの基礎的な肺機能、疾患重症度、および増悪頻度と有意に関連しており、MUC5AC遺伝子発現と肺機能との間に有意な逆相関があることが明らかであった。この負の相関は、COPD SPIROMICS コホートに対して実施された最近の多施設研究と一致しており、肺機能の低下（予測 FEV1 %）に関連して COPD における MUC5AC 喀痰濃度の増加が実証されています 45。したがって、MUC5AC は COPD を予後する潜在的なバイオマーカーとして提案されています。

タバコの煙、炎症刺激、タンパク質分解酵素、または遺伝子改変への曝露がない場合の COPD オルガノイドの単細胞トランスクリプトームは、表現型、トランスクリプトーム、および機能レベルで既存の in vitro および in vivo COPD モデルと高い一貫性を示します 46。サンプルサイズは小さいものの、47 件あります。これらの分析はまた、COPD 杯細胞過形成をさらに明らかにし、その病因を特徴付ける本質的に異常な細胞発達による COPD における細胞分化の中断を示しています。私たちの擬似時間解析は、COPD気道で観察されるNOTCH、Wnt/β-カテニン、ヘッジホッグシグナル伝達経路など、組織の発生、再生、上皮分化における欠陥を実証する既存の研究と一致しています48、49、50。ミトコンドリア機能不全やサーチュインシグナル伝達など、COPD に関連する生物学的経路は、COPD オルガノイドの単一細胞特性評価によって明らかになりました。これには、バルク RNAseq には反映されない少数の細胞集団を評価できるという大きな利点があります 51,52,53。肺上皮におけるミトコンドリアの構造と機能の障害は、細胞分化、細胞死、細胞リモデリングから物理的バリア機能や自然免疫に至るまでの重要なプロセスに影響を及ぼし、これらはすべてタバコの煙への曝露を介した COPD の発症に関連しています 54。ミトコンドリア生合成の調節不全と活性酸素種 (ROS) の産生の増加は、特に COPD に見られるように、酸化剤と抗酸化剤の能力の不均衡を伴う場合、不可逆的な細胞増殖停止または老化を引き起こす可能性があります 55,56。私たちの発見と一致して、これはクラブ細胞、他の気道上皮細胞タイプと比較して酸化損傷に非常に敏感な細胞で最も明らかです57。さらに、サーチュイン 1 (SIRT1) は COPD の発症と進行、およびウイルス感染に対する感受性に関与しているとされています 58,59。 SIRT1 レベルの低下は COPD 肺で観察され、核 RelA/p65 のアセチル化および IL-8 放出の増加による炎症の増強と関連しています 59,60。一貫して、免疫応答に関連する遺伝子の活性化の増加が、COPD オルガノイドの基底細胞、クラブ細胞、および杯細胞で検出可能です。興味深いことに、COPD BOでは異なる細胞プロファイルが同定されましたが、「基底細胞2」、「クラブ細胞2」および「杯細胞2」が過剰に存在する他のオルガノイドでは同定されませんでした。鼻上皮は、COPD 関連遺伝子の検出において気管支領域の代理として機能することが示唆されています 61,62 が、我々は、上気道と下気道に由来するオルガノイドモデルが同様の COPD 関連遺伝子発現プロファイルを示すことを実証しました。異なる細胞プロファイル。

現在の証拠は、COPD患者は入院、ICU入室、人工呼吸器の必要性、死亡率などの重篤な新型コロナウイルス感染症のリスクが高いことを示唆している27,28,63,64,65,66。この研究では、臨床背景に関係なく、当社のオルガノイドモデルは、主要なSARS-CoV-2侵入因子と、ACE2、TMPRSS2、フリン、ニューロピリン-167、68、69、70、71を含むそれらに関連する内因性プロテアーゼの発現を実証しています。 ,72。 ACE2 および TMPRSS2 の発現は COPD オルガノイド (NPO) で有意に上昇しており、この所見は喫煙者および COPD 患者の気道で見られた既存の報告と一致しています 73,74,75,76。 2020年に同定された系統発生的に異なる3つのSARS-CoV-2クレード、すなわちクレードL、クレードO、クレードGを用いて、D614Gスパイク変異を含むGクレード分離株がより高いウイルス力価まで複製され、より強力な炎症誘発性反応を示したことを示した77,78。 D614G 変異を欠く分岐群の L 株および O 株と比較して、延長された時点でも同様です。これは、動物 79、80、81、82 および人間の気道モデル 81、83 での以前の研究と一致しています。重要なことに、我々は、COPDオルガノイドがSARS-CoV-2感染に対してより脆弱であり、その結果、G-614Gの感染後、特に気管支領域においてIFN-β発現のより大きな複製と阻害を引き起こすことを実証した。このより高い複製能力は、G-614G感染後の抗ウイルス免疫反応の低下と相まって、新型コロナウイルス感染症（COPD）患者で観察されるより悪い臨床転帰を部分的に説明する可能性のあるメカニズムに関する洞察を提供する。興味深いことに、より効率的なウイルス複製は COPD 患者由来の BO でのみ実証されましたが、NPO では非罹患患者と比較して対照的な効果が観察されました。この興味深い結果は、COPD BO における「基底細胞 2」、「クラブ細胞 2」、「杯細胞 2」の細胞集団が IFN-β の阻害と結合して過剰に存在することが寄与している可能性があります。私たちの発見と一致して、最近の研究では、COPD患者由来の気管支上皮細胞は、共受容体の発現、プロテアーゼの不均衡、およびより強力な炎症反応が豊富であるため、SARS-CoV-2感染に対してより感受性が高いことが実証されました84。

ウイルスは依然として COPD 増悪の主要な引き金であり 85、COPD における抗ウイルス免疫の欠如はウイルス誘発性増悪のリスクの増大と関連しています 86,87。ライノウイルスおよび/またはインフルエンザ感染後の COPD 気管支における IFN 発現の低下が観察される一方、安定した COPD から切除された肺では IFN-β、IRF-7、およびその他のインターフェロン刺激遺伝子 (ISG) の構成的障害が示されています 88,89,90,91 。頻繁に起こる COPD の増悪者は、重症患者で最も顕著であり、臨床的安定期であっても喀痰中の I 型および III 型インターフェロンおよびその他の ISG のさらなる減少を示します 91,92,93。重要なのは、この研究は、インターフェロン反応の障害がSARS-CoV-2感染後にも同様に関連している可能性があることを示すことで、これらの観察をさらに補強するものである。

細菌も同様に COPD 増悪の原因物質として重要な役割を果たしており、肺炎球菌と緑膿菌は最も頻繁に分離される細菌種の 2 つです 94,95,96。 COPDの喀痰から細菌が分離されるのは、安定期の中等度から重度の疾患患者の最大50%であり、増悪時には3分の2に増加する97,98。 COPD 気道内の細菌の存在による炎症の影響は、急性増悪に関連するものを含め、肺機能の低下と入院の長期化に関連しています99,100。 COPDオルガノイド（NPO）、特に頻繁な増悪者に由来するものは、同等の感染許容性にもかかわらず、肺炎球菌と緑膿菌の両方に対する炎症反応の亢進を明らかにしており、この患者群で観察される臨床転帰の不良の一因となっている。 COPDオルガノイドの使用により、潜在的な病原性微生物に対する炎症反応を個人レベルで洞察できる可能性があり、COPDにおける抗炎症療法または抗菌療法の評価に精密なアプローチを適用するのに役立つ可能性があります。

私たちは初めて COPD オルガノイドを確立し、特徴づけましたが、私たちの研究にはいくつかの限界があります。オルガノイドモデルを作成するための出発材料として使用する鼻咽頭および気管支のサンプリングは、個人からのペアの標本ではなく、異なる個々のドナーから収集されました。罹患していない（健康な）オルガノイドの生成に使用されるヒトサンプルは、COPD サンプルと比較して比較的若いドナーから採取されました。我々が提示した scRNA 分析は、各グループの単一サンプルに基づいているため、これらの発見を検証するにはさらなる実験が必要です。当社の COPD オルガノイドは生理学的に適切であり、ヒトの気道上皮を代表するものですが、この分野で進行中の課題である免疫系や血管系などの複雑さが欠けています。 SARS-CoV-2に感染したオルガノイドからscRNAデータを取得することは興味深いことであったが、これらの実験は安全性と物流上の理由から除外された。

要約すると、根底にある疾患状態を構造的および機能的に表す宿主と病原体の相互作用を研究するために、COPDオルガノイドを確立して特徴付けます。このようなモデルは、感染および/または薬物治療に対する反応を個人レベルで評価することを可能にし、ハイスループットの治療スクリーニングや進化する病原体の疾患ベースの評価に適した、将来のパンデミック対策戦略に有用な追加機能を形成する可能性があります。

NPO と BO の育成と特性評価のために、COPD ではない (健康な) ボランティア (n = 10) と COPD 患者 (n = 18) を含む 28 人の個人が募集されました。以下に説明する肺切除および/または光ファイバー気管支鏡検査によって収集された植毛鼻咽頭スワブ (FNPS) および/または気管支標本を実験の出発材料として入手しました。

スパイロメトリーが正常で、COPDまたは他の呼吸器疾患の既往歴がない被験者が募集されました。参加者全員は生涯非喫煙者であり（元喫煙者 1 名を除く）、参加者全員が長期の投薬を受けていませんでした。参加者の人口統計は補足表 2 にまとめられています。

定期的なフォローアップのために三次紹介センターの呼吸器外来診療所に通う、安定した COPD を患う 45 歳以下の患者が、シンガポール総合病院 (シンガポール)、セントビンセンツ病院 (オーストラリア、シドニー)、ジョン病院の 2 か国の 3 つの病院で募集されました。ハンター病院（オーストラリア、ニューカッスル）。 COPD は、慢性閉塞性肺疾患に対する世界的イニシアチブ (GOLD) の基準に従って定義されました 1,101。喘息の既往歴のある患者（Global Initiative for Asthma ガイドライン (www.ginasthma.org) に従って、さまざまな症状と呼気流制限によって定義される）および長期経口ステロイドまたは免疫抑制剤を投与されている患者は除外されました。安定したCOPDは、研究募集の4週間前に増悪が見られないこととして定義された。非増悪者（NE）は、研究募集の前年に文書化された増悪が存在しないことによって定義され、一方、COPD増悪者（E）および頻繁な増悪者（FE）は、その年に増悪がそれぞれ2回未満または2回以上であると定義されました。先行研究募集。 COPDの増悪は、患者の主治医の判断に応じて、追加の治療（ステロイドおよび/または抗生物質）を必要とする呼吸器症状（咳、痰の産生、息切れおよび/または喘鳴）の突然の悪化として定義されています1。頻繁に COPD を悪化させる患者については、GOLD ガイドラインに基づいて COPD 治療を受けているにもかかわらず、再発性の悪化の既往歴が記録されている 1,101。募集された患者は全員、ワクチン接種に加えて、適切なCOPD治療（禁煙カウンセリング、吸入器評価、COPD行動計画、長時間作用型β作動薬、長時間作用型ムスカリン拮抗薬、吸入コルチコステロイドおよび/または短時間作用型気管支拡張薬などの吸入薬を含む）を受けていた。適切）GOLD ガイドライン 1,101 に基づいています。すべての患者は、ATS/ERS基準によって定義された技術基準に従って、完全な肺活量測定（予測1秒パーセント（FEV1％予測）での努力呼気量、FEV1努力肺活量、FVCおよびFEV1/FVC比を決定するため）を受けました。以下に説明する鼻咽頭および/または気管支のサンプリング102．研究参加者の完全な臨床データと人口統計の詳細は、補足表 2 に記載されています。

この研究は、参加したすべての病院および施設の治験審査委員会（IRB）によって承認され、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。各施設の倫理承認に関する参照番号は次のとおりです: CIRB 2020/2338 (シンガポール)、IRB-2020-05-004 (シンガポールの南洋理工大学)、X02-0137 (オーストラリアのシドニー南西部保健サービス)および H-163-1205 (オーストラリア、ハンターニューイングランド LHD 倫理委員会)。この研究で使用されるウイルスの分離では、前述のように、培養用の患者サンプルが PROTECT (2012/00917) によって提供されたガイドラインに従って収集されました 103。これは、National Healthcare Group によって承認された、新規の病原体を検出し、新たな感染症を特徴付けるための多施設前向き研究です ( NHG) は、シンガポールにおける国家的疾病の発生に対するパンデミックへの備えの一環として行われます。 Duke-NUS Medical School 動物生物学的安全性レベル 3 (ABSL-3) 研究室で行われた研究は、Duke-NUS ABSL3 Biosafety Committee、シンガポール国立大学、およびシンガポール保健省によって承認されました (BSL3/2007-03/) DA)。

鼻咽頭サンプリングは、BBL Universal Viral Transport Standard Kit を備えた植毛鼻咽頭スワブ (FNPS) を使用して、訓練を受けた担当者によって確立されたプロトコールに従って実行されました。簡単に説明すると、FNPS を鼻孔に適切な深さまで挿入し、除去する前に数回回転させました 104。サンプルは、処理のために直ちに氷上で研究室に移されました。ＨＮＰＥＣは輸送媒体で少なくとも２０回洗い流すことによってスワブから放出された。次に、細胞をヒトコラーゲンIVでプレコートした6ウェルプレートにプレーティングし、5μMのN-[N-(3,5-ジフルオロフェナセチル)-L-アラニル]を補充したB/D増殖培地（補足表3）で培養しました。 -S-フェニルグリシン t-ブチルエステル (DAPT) は単層として成長します。コンフルエンスに達するまで、培地を48時間ごとに交換した。

気管支サンプリングは、臨床適応症および前述の標準ガイドラインに従って、肺切除、移植および/または光ファイバー気管支鏡検査を受ける患者に対して実施されました105、106。開胸術で得られた肺組織を解剖し、気道を分離した。次に、上皮を巨視的解剖によって間質層から除去した。気管支鏡検査によって得られたサンプルでは、HBEC は、直視下で適用された単一のシース付きナイロン細胞診ブラシを使用して得られました。第 2 世代から第 3 世代の気管支から約 4 ～ 8 回のブラッシングを行い、ブラシから細胞を DMEM で洗浄しました。次いで、細胞を組織培養フラスコ内の成長サプリメントを含む気管支上皮成長培地（BEGM）中でプレーティングし、コンフルエンスに達するまで48時間ごとに培地を交換した。

HNPEC および HBEC が単層としてコンフルエントに達した後、2 × 105 個の細胞を 30 μg/ml PureCol でプレコートした 24 ウェルトランスウェルの頂端チャンバーに播種しました。 HNPEC または HBEC を含むトランスウェルを最初に液中相で培養し、細胞層が完全に無傷になったら、頂端チャンバー内の培地を除去し、その後細胞を ALI で培養しました。培地を週に2回更新し、ALI分化（ALI-Diff）培地（補足表4）を使用して細胞を18日間分化させ、その後気道オルガノイドに分化させました。

18日間分化したALI-HNPECまたはALI-HBECをTrypLEでトランスウェルから剥離し、マトリゲルに再懸濁し、25％R-スポンジン-1馴化培地、25 ng /を補充した気道オルガノイド（AO）培地（補足表5）で培養しました。拡張用に ml FGF7 および 100 ng/ml FGF10。細胞は拡張され、マトリゲル内で球状構造を形成しました。 5 日目の増殖時に、ALI でさらに 4 ～ 6 週間分化するために、スフェロイドを 12 ウェルインサートの頂端チャンバーに継代しました。オルガノイドが十分に分化するまで、5 ng/ml FGF7および20 ng/ml FGF10を含むAO培地を使用して培地を週に2回4〜6週間交換した。

頂端アウトオルガノイドの生成方法は、他の人によって以前に報告されています107,108。簡単に説明すると、NPO および BO を 12 ウェルインサートから収集し、100 単位/ml ペニシリンおよび 100 μg/ml ストレプトマイシン (P/S) を含む高度な (ad) DMEM/F12 で 2 回洗浄しました。洗浄した NPO と BO を、PBS 中の 5 mM EDTA とともに回転させながら 4 °C で 1 時間インキュベートして、残りのマトリゲルを可溶化しました。 NPO と BO を 200x g、4 °C で 5 分間遠心分離し、上清を除去しました。ペレットを５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７および２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０を補充した培地に再懸濁し、超低付着性２４ウェル組織培養プレートを使用して懸濁液中で培養した。感染調査の前に、懸濁された NPO および BO を 37 °C、5% CO2 で 3 日間インキュベートしました。

この研究では 3 つの SARS-CoV-2 株が使用されました。そのうちの 1 つは、(1) クレード L の祖先武漢株、hCoV-19/シンガポール/2020/2/2 (L-WU) (GISAID アクセッション ID: EPI_ISL_407987)。 (2) 2020 年半ばに分離されたクレード O 由来の株、hCoV-19/Singapore/1003/2020 (O-614D) (GISAID アクセッション ID: EPI_ISL_574486) (3) クレード G 由来の D614G 変異体、hCoV-19/ Singapore/1005/2020 (G-614G) (GISAID アクセッション ID: EPI_ISL_574489)。 3 つの株の配列比較を補足表 1 に示します。ウイルスは、37 °C、5% CO2 で 5% ウシ胎児血清 (FBS) および 1% P/S を添加した DMEM で培養した Vero-E6 細胞で増殖しました。細胞変性効果 (CPE) が観察されたら、細胞培養上清を回収し、遠心分離し、等分しました。ウイルス力価は、Karber 法 109 を使用した限界希釈によって決定されました。

Vero-E6細胞を感染させて、組織培養感染量(TCID50/ml)を測定した。 96 ウェルプレート内の Vero-E6 細胞を滴定アッセイに利用しました。サンプルをDMEMで連続希釈し、5% FBSおよび1% ペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました。細胞を 100 μL の希釈サンプルで 4 回感染させました。細胞を 37 °C、5% CO2 で 4 日間インキュベートしました。インキュベーション後、CPE を含むウェルを記録し、Karber 法を使用した限界希釈によって各サンプルの無細胞ウイルス力価 (TCID50/mL) を決定しました109。

Vero-E6 細胞を 24 ウェル組織培養プレートに播種し、感染多重度 (MOI) 0.01 で SARS-CoV-2 に感染させ、3 つの株のウイルス複製動態を決定しました。上清を24、48、72および96 hpiで採取し、ウイルス力価を測定した。

感染前に、頂端アウトＮＰＯおよびＢＯを１％Ｐ／Ｓを含むａｄＤＭＥＭ／Ｆ１２で１回洗浄し、１ｍｌのＡＯ培地に再懸濁した。 50μlのオルガノイドを採取し、細胞計数のためにTrypLE Expressで解離させ、MOI = 0.1で使用する総細胞数とウイルス量を決定しました。心尖部アウトNPOおよびBOは、超低付着プレート上の懸濁液中のSARS-CoV-2に37℃、5%CO2で1時間感染させた。 1時間のインキュベーション後、感染したNPOおよびBOをadDMEM/F12および1% P/Sで3回洗浄しました。オルガノイドを 75% マトリゲルに再包埋し、24 ウェル培養プレート上にオルガノイド液滴あたり 30 μl として播種しました。マトリゲルが固化した後、500μlのAO培地をそれぞれのウェルに加えた。次いで、TCID50 アッセイおよび Luminex アッセイのために、細胞培養上清を 1、24、48、72、および 96 hpi で収集しました。以下に記載する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）分析のために、細胞溶解物をβ-メルカプトエタノールを含む緩衝液RLT中に48および72 hpiで収集した。

緑膿菌 PAO1110 株をトリプシン大豆ブロス (TSB) 中で 37 °C で一晩振盪培養しました。肺炎球菌株 INS-E611 (血清型 6B)111 を、Todd Hewitt Broth (THB) 中で 37 °C、5% CO2 で一晩培養しました。一晩細菌培養物を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄した後、ＯＤ６００ｎｍ測定により細菌濃度を測定した。感染前に、緑膿菌は5×106 CFU/mlの濃度に希釈し、肺炎連鎖球菌は抗生物質を含まないAO培地で7.5×106 CFU/mlの濃度に希釈しました。細胞数を測定した後、頂端から出たNPOを懸濁液中で37℃、5％CO2で1時間感染させた。 1時間のインキュベーション後、感染したNPOをadDMEM/F12および1% P/Sで3回洗浄しました。次いで、NPO を 75% マトリゲルに再包埋し、24 ウェル培養プレート上にオルガノイド液滴あたり 30 μl として播種しました。マトリゲルが固化した後、300μg/mlのゲンタマイシンを含む500μlのAO培地(抗生物質を含まない)をそれぞれのウェルに添加した。細胞溶解物は、qPCR 分析のために 6 hpi でβ-メルカプトエタノールを含む緩衝液 RLT に収集されました。 Luminex アッセイを使用して分泌サイトカインおよびケモカインを検出するために、細胞培養上清を 6 hpi で収集しました。

マトリゲルまたは懸濁液中で培養された気道オルガノイド (AO) は、ABSL3 施設内で Nikon 倒立顕微鏡 Eclipse Ti-U Nikon を使用して指定の倍率で画像化および/またはビデオ撮影されました。

無傷のオルガノイドを4%パラホルムアルデヒド中で室温で30分間固定し、その後PBSで洗浄し、PBS中の0.2% Triton X-100で30分間透過処理した。これに続いて、染色緩衝液(PBS中1% BSA、0.2% Triton X-100)で1時間ブロッキングした。次に、オルガノイドを、染色緩衝液で希釈した抗ACE2、抗アセチル化チューブリン、抗MUC5AC、抗TP63および抗SCGB1A1を含む一次抗体とともに室温で3時間インキュベートし、その後PBSで3回洗浄した。 AlexaFluor 488、594、または 647 標識二次抗体、ファロイジンおよび 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) をオルガノイドとともに室温で 1 時間インキュベートしました。オルガノイドは、ProLong™ Glass 退色防止封入剤を使用してスライドガラスにマウントされ、カバーガラスで覆われました。画像は、Zeiss LSM 800 共焦点顕微鏡を使用して取得し、ZEN 画像解析ソフトウェア (Zeiss) を使用して処理しました。この研究で使用された抗体の情報は補足表 7 にリストされており、この研究で使用されたすべての一次抗体は検証されました ((補足図 13、14)。

感染の有無にかかわらず、NPO および BO からの全 RNA を、製造元の指示に従って RNeasy Plus Mini Kit を使用して抽出しました。次に、PrimeScript RT Reagent Kit を使用して逆転写を実行し、次の条件下で cDNA を生成しました: 37 °C で 15 分間、85 °C で 5 秒間、その後 4 °C でインキュベート。 GoTaq® qPCR SYBR green Master Mix を使用して、次の条件下で cDNA を希釈および増幅しました: 95 °C で 2 分間、続いて 95 °C で 3 秒間、および 60 °C で 30 秒間、合計 40 サイクル。 SARS-CoV-2 N 遺伝子は、同じ条件下で GoTaq® Probe qPCR Master Mix を使用して増幅されました。この研究で使用したプライマーとプローブの配列を補足表 6 にまとめます。SARS-CoV-2 感染サンプルを含む qPCR 増幅は、ABSL3 施設内の CFX96 Touch リアルタイム PCR 検出システム (Bio-Rad) で実行されました。 -SARS-CoV-2 関連の研究は、QuantStudio 6 Flex リアルタイム PCR システム (Thermofisher Scientific) で実行されました。プラスミド DNA で作成した標準曲線を使用して、TP63、SCGB1A1、FOXJ1、MUC5AC、ACE2、TMPRSS2、Furin、Neuropilin-1、および SARS-CoV-2 N 遺伝子の絶対定量を実行しました。緑膿菌 16 S、肺炎連鎖球菌 lytA、IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-β、TNF-α、CCL2、CCL5、および CXCL10 mRNA の相対量 (β-アクチンで正規化) を決定しました。 2−ΔΔCt 法を使用します112。

48 および 72 hpi の SARS-CoV-2 感染 NPO および BO、および 6 hpi の緑膿菌および肺炎球菌感染 NPO の細胞培養上清を、Bio-Plex Pro Human サイトカインスクリーニングパネルを使用した多重サイトカインアッセイに供しました。 Biorad）は、製造元の指示に従って 48 種類のヒトサイトカインを含有します。スペクトル強度は、SARS-CoV-2 および細菌感染の研究のために、それぞれ MagPix マシン (Luminex Corporation) および Bio-Plex 200 System (Bio-Rad) で定量化されました。サイトカイン濃度は、5PL 曲線フィッティングを通じて標準曲線から補間することにより計算されました。

μOCT テクノロジーは以前に説明されています 113、114、115、116。簡単に言うと、µOCT システムには、スペクトルドメイン OCT (SD-OCT) イメージングコンソールとベンチトッププローブが含まれていました。スーパーコンティニューム光源が 50/50 ビームスプリッターを照らしました。光源の光の半分はベンチトッププローブに送信され、プローブから返された光は分光計に中継されました。分光計は、960 ライン/mm 体積位相ホログラフィック透過回折格子、多要素カメラレンズ、およびラインスキャンカメラで構成されました。リファレンスアームから反射した光とサンプルアームから散乱して戻ってきた光は、ビームスプリッターで結合されてコンソールに戻ります。横方向 (x、y) スキャンは、アナログ出力ボードによって駆動される一対の検流計スキャナーを使用して実行されました。カメラの出力は画像取得ボードに転送されました。

μOCT イメージングは、オルガノイドの上面から照明を当ててヒト BO に対して実行されました。幾何学的測定の誤差を最小限に抑えるために、イメージング光学軸は通常、細胞面の法線から 10°以内に配置されます。繊毛拍動周波数 (CBF) は、時系列の画像を使用して決定され、振動挙動を示す画像領域のピーク振幅の周波数を定量化することによって評価されます。 CBFを決定するために、画像シーケンスごとに最大10の毛様体の活動領域でドナーあたり平均6〜10のオルガノイドが評価されます。すべての画像解析は、ImageJ と MATLAB を使用して実行されました。

単一細胞 RNA シークエンシングは、製造元の指示に従い、Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM Library & Gel Bead Kit V3.1 の標準プロトコルに従って実行されました。簡単に説明すると、NPO と BO を adDMEM/F12 で 1 回洗浄してマトリゲルを除去し、その後 TrypLE Express と 10 分間インキュベートしました。次に、大きな非解離構造を P1000 チップで繰り返し通過させることにより、単細胞懸濁液が得られました。単一細胞を遠心分離し、細胞計数のために AO 培地に再懸濁して、1000 細胞/μl の密度を得ました。セルは Chromium Next GEM チップ G にロードされ、Chromium コントローラーで実行されました。配列決定ライブラリーは、標準的な製造業者のプロトコールに従って調製されました。 DNA ライブラリーは、シンガポールの南洋理工大学環境生命科学工学センター (SCELSE) にある配列決定施設の Illumina HiSeq2500 v2 プラットフォーム (28x91bp) でペアエンド配列およびシングルインデックス配列が行われました。

Cell Ranger 6.0.2を使用して、非疾患者およびCOPDのNPOおよびBOからの生のfastqリードをヒトGRCh38参照ゲノムとアラインメントしました。次に、単一細胞数マトリックスを Seurat 4.0117 で分析しました。検出された遺伝子が 200 個未満で、ミトコンドリア遺伝子が 20% を超える細胞は除外されました。次に、フィルタリングされたデータセットは、Seurat の SCTransform 関数を使用して正規化され、統合されて、非疾患 (1 つの NPO-ND ラインと 1 つの BO-ND ラインのプール) と COPD (1 つの NPO のプール) の間の下流比較分析用の統合データ配列が得られました。 -COPD ラインと 1 つの BO-COPD ライン)。

細胞クラスタリングは、解像度パラメータを 0.3 に設定して実行されました。図示のように、非線形次元削減を使用して、統一された疾患状態固有の UMAP プロットを構築しました。 Seurat FindAllMarkers および FindMarkers 関数をそれぞれ使用したノンパラメトリック Wilcoxon 順位和検定に基づいて差次的発現解析を実行し、各細胞クラスターの遺伝子マーカーと、非罹患細胞と COPD 細胞の間で差次的に発現された遺伝子 (DEG) を特定しました。機能強化分析は、Ingenuity Pathway Analysis (Qiagen) および GSEA118 を使用して実施されました。 COPD オルガノイドモデルを検証するために、COPD の培養気道上皮細胞および/または臨床生検の公的に利用可能な公開バルク RNAseq データセットからの、DEG に基づく上位の濃縮された関数と、当社の scRNA-seq データセットからの関数を比較しました 119。 3 つの関連データセット (アクセッション番号: GSE124180、GSE146532、および GSE162154) が特定され、Rsubread 3.6.2 を使用して Ensembl 遺伝子 ID120 にマッピングされました。ただし、GSE124180 および GSE146532 は、非疾患サンプルセットと COPD サンプルセットが明確なクラスターを形成しなかったため、除外する必要がありました。主成分分析 (PCA) に基づいて相互に比較します。したがって、比較分析には GSE162154 のみが使用されました。バルク RNAseq データセットは Gene Expression Omnibus (GEO) からダウンロードされました。

細胞型のアノテーションは、Blueprint、ENCODE、および celldex (1.2.0) を使用する Human Primary Cell Atlas データベースを使用して最初に分析され、すべての細胞が上皮表現型を示すことが確認されました 121。それぞれのクラスターの細胞型を決定するために、GSEA を使用して Garcia らの気道細胞および肺細胞の特徴遺伝子セットとそれぞれ比較しました。 (2019)36 および Travaglini et al. (2020)それぞれ37。 Monocle3122 を使用して擬似時間解析を実行し、ルートノードとして指定された周期基底細胞を使用して細胞軌跡を推定しました (軌跡の原点、擬似時間 = 0)。

非罹患およびCOPDのNPOを模擬治療するか、緑膿菌（PAO1）に6時間感染させた。次いで、オルガノイドをQiagen RLT plus緩衝液で溶解し、Qiagen RNeasy Plus Mini Kitを使用してRNAを単離した。各サンプルの鎖状 mRNA ライブラリーは、Illumina TruSeq 鎖状 mRNA キットを使用したオリゴ dT 精製により調製されました。 Illumina HiSeq2500 システムを使用して、ライブラリーのペアエンド 100 bp (PE100) を配列決定しました。

FASTQ 形式の生のペアエンドシーケンスデータ (NCBI の Gene Expression Omnibus (GEO) データベースで入手可能: GSE201465) を、trimmomatic-0.39 (パラメーター: /trimmomatic-0.39/adapters/TruSeq3-PE-) を使用してアダプターシーケンス/低品質シーケンス用にトリミングしました。 2.fa:2:30:10:1:TRUE LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:30).トリミング後のシーケンスリードの品質は、FastQC v0.11.8 を使用してチェックされました。トリミングされたシーケンスリードは次にマッピングされました。ヒト参照ゲノム GRCh38.p13 (hg38) は、Rsubread v2.6.4 で利用可能な align 関数を使用し、R v4.1.0 ソフトウェアで実行されました (パラメーター: Type=rna)。特徴数の抽出は、Rsubread v2 で利用可能な featureCounts 関数を使用して実行されました。 .6.4 を R v4.1.0 ソフトウェアで実行しました (パラメータ: annot.ext=hg38.ensGene.gtf、isGTFAnnotationFile=TRUE、isPairedEnd=TRUE)。

DESeq2 (v1.34.0)123 を使用して、差次的遺伝子発現を実行しました。 log2 倍数変化が >± 1 であり、調整された p 値が <0.05 である場合、遺伝子は差次的に発現しているとみなされました。模擬処理された緑膿菌感染非罹患NPOおよびCOPD NPOの間のすべての差次的発現遺伝子（DEG）は、その発現傾向に基づいて階層的クラスタリングを受けて、5つの主要な遺伝子クラスターを形成しました。各遺伝子クラスターの強化された遺伝子オントロジー用語は、ViSEAGO124 を使用して分析されました。

感染に関連しない実験については、図1〜3に記載されています。 1 ～ 3、n = 7。 n = 10; n = 3 および n = 8 の生物学的に独立した複製を NPO 非罹患 (ND) に使用しました。 NPO-COPD; それぞれ BO-ND と BO-COPD。図1〜3に記載されている感染研究については、 4〜6では、少なくともn = 3の生物学的に独立した反復が実行されました。データは、GraphPad Prism ソフトウェア (バージョン 8.3.0) を使用して分析されました。コルモゴロフ・スミノフ検定 (KS 検定) を使用して、連続データの正規性を検定しました。データは正規分布データの平均と標準誤差として表示され、必要に応じてグループ間の差異を評価するためにスチューデント t 検定または分散分析 (ANOVA) が使用されます。非正規変数の場合、中央値は四分位範囲で表示され、2 つのグループを比較する場合にはウィルコクソンの符号付き順位検定 (対応のあるデータ) およびマン-ホイットニーの U 検定 (対応のないデータ) が実行され、および/または 2 つのグループを超える場合にはクラスカル-ウォリス検定が実行されます。、それぞれ。スピアマンの相関係数（ノンパラメトリック）分析を実行して、特定の遺伝子発現レベルと第 1 秒予測パーセント（予測 FEV1%）における努力呼気量の間の相関を評価しました。 p 値 <0.05 は有意とみなされ、有意度は次のように示されます。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 および ****P < 0.0001。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

単一細胞 RNA シーケンス: 非疾患者および COPD の NPO および BO からの生の fastq リードをヒト GRCh38 とアライメントしました。 p13 (hg38) 参照ゲノム。培養気道上皮細胞および/または COPD の臨床生検の 3 つの公的に利用可能な公開バルク RNAseq データセット ((アクセッション番号: GSE124180、GSE146532 および GSE162154)) を、当社の scRNA データセットとの比較に使用しました。この研究は、アクセッションコード GSE186017 で GEO データベースに登録されています。

バルク RNA シーケンス: 生の FASTQ リードをヒト参照ゲノム GRCh38.p13 (hg38) にマッピングしました。この研究で生成されたバルク RNA シーケンスデータは、アクセッションコード GSE201465 で GEO データベースに保管されています。

この研究の主要な発見を裏付けるその他すべての関連データは、論文とその補足情報ファイル内で入手できます。ソースデータはこの文書で提供されます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

単一細胞 RNA-seq 解析用の R スクリプトは、https://github.com/chenghongsheng/SC_RNAseq-airway-organoid および https://doi.org/10.5281/zenodo.7290276 で入手できます。

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この研究は、シンガポール保健省の国家医学研究評議会 (MOH-000409) (SHC 宛) および国立医学研究評議会 COVID19RF2-0006 (LF.W 宛) が管理する COVID-19 研究基金の下、シンガポール国立研究財団によって支援されました。および DEA)、およびシンガポール保健省の National Medical Research Council の Clinician Scientist Award (CSA) (MOH-000710) (SHC) によって承認されています。 LLYC は、Dean's Postdoctoral Fellowship および Wong Peng Onn Fellowship (002823-00001) のもと、南洋理工大学 Lee Kong Chian 医学部によって支援されています。 Vero-E6 細胞培養の支援については、南洋理工大学 Lee Kong Chian 医学部の Ter Soo Kai 氏に感謝します。鼻咽頭スワブの収集と輸送の調整にご協力いただいたシンガポール総合病院のマーヴィン・オン氏に感謝します。物流管理と支援をしていただいたデューク NUS メディカルスクール ABSL3 施設の Viji Vijayan 博士と Benson Ng 氏に感謝します。著者らは、共同研究を支援してくださった TARIPH Center of Respiratory Research Excellence に感謝の意を表します。図１および図２に模式図を示す。 1a、4a、b、および 6a は BioRender.com で作成されました。

これらの著者は同様に貢献しました: Lin-Fa Wang、Sanjay H. Chotimall。

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サンジェイ・H・チョティモール

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LLYC、LF.W. そしてSHCは研究を概念化した。 LLYC はヒト気道オルガノイドを確立し、ウイルスおよび細菌の感染実験、共焦点イメージングおよびデータ分析を実施しました。 DEA、AEZK、RF、AMGはウイルス感染実験とデータ分析を実施した。 LLYC と HSC は単一細胞ライブラリーの調製を実行しました。 HSC、FXI、および NST は、単一細胞およびバルク RNA トランスクリプトーム解析を実行しました。 SC と LL は μOCT イメージングと分析を実行しました。 TPY、MSK、KCH L、および YTW は臨床サンプルを収集しました。 BGO と PABW は気管支標本を提供した。 KN と PSP はヒト気管支上皮細胞を培養しました。 YLC は抗体検証のために免疫染色を実施しました。 LLYC と SHC が原稿を書きました。すべての著者が原稿の編集に貢献しました。

Louisa LY Chan または Sanjay H. Chotimall への通信。

SHCはCSLベーリング、ニューマゲン社、ベーリンガーインゲルハイム社の諮問委員会の一員であり、アストラゼネカから講演料を受け取り、イノヴィオ・ファーマシューティカルズ社とイマーム・アブドゥルラフマン・ビン・ファイサル大学のデータ安全監視委員会（DSMB）の委員を務めているが、これらはすべて提出された研究以外のものである。。他のすべての著者には開示すべき矛盾はありません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

チャン、LLY、アンダーソン、DE、チェン、HS 他宿主と病原体の相互作用を研究するためのCOPDオルガノイドの確立により、気管支におけるSARS-CoV-2のウイルス適応度が強化されていることが明らかになった。 Nat Commun 13、7635 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-35253-x

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受信日: 2021 年 10 月 25 日

受理日: 2022 年 11 月 22 日

公開日: 2022 年 12 月 10 日

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