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Nature Communications volume 14、記事番号: 798 (2023) この記事を引用

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呼吸器合胞体ウイルス (RSV)、ヒトメタニューモウイルス (HMPV)、ヒトパラインフルエンザウイルス 1 型 (HPIV1) および 3 型 (HPIV3) は、免疫不全患者、高齢者、肺疾患の基礎疾患を持つ患者に重篤な疾患や死亡を引き起こす可能性があります。 RSV に対する防御モノクローナル抗体は存在しますが、臨床使用は高リスクの乳児集団に限定されています。 したがって、脆弱な患者集団に対するこれらのウイルスの治療選択肢は現在限られています。 ここでは、HPIV3 と HPIV1 の両方を標的とするものと、RSV と HMPV の両方を標的とする 2 つの交差中和モノクローナル抗体の発見、インビトロでの特性評価、およびインビボでの有効性試験を紹介します。 3×1 抗体は複数のパラインフルエンザ ウイルスを標的にすることができます。 MxR 抗体は、RSV と HMPV の両方を中和できる他の以前に報告されたモノクローナル抗体と特徴を共有しています。 我々は、抗原と複合体を形成したこれらの抗体の低温電子顕微鏡法を使用して、HPIV3に結合した3×1については3.62Åの分解能で、RSVに結合したMxRについては2.24Åの分解能で構造を取得し、in vitroの結合と中和の構造的基礎を提供しました。 3 × 1 と MxR のカクテルは、リスクのある個人に重大な罹患率と死亡率を引き起こす 4 つの呼吸器ウイルスに対する広範な保護を提供するという臨床的有用性を持つ可能性があります。

呼吸器系ウイルスは世界中で主要な死因であり、2015 年には呼吸器系ウイルスが原因で死亡すると推計 270 万人に上ります 1。 RSV 感染を予防するワクチンの開発は近いかもしれません 2,3 が、HMPV、HPIV3、および HPIV1 に対する防御ワクチンはまだ臨床的に利用可能ではありません。 これら 4 つの呼吸器ウイルスに対する防御ワクチンが存在したとしても、高度に免疫不全状態にある人にワクチンを接種しても防御免疫が達成されることはほとんどありません。 さらに、免疫除去療法前のワクチン接種は効果がないか、すぐに効果が弱まってしまうことが多く、持続的な防御を維持できません4、5、6。 RSV、HMPV、HPIV1、および HPIV3 は、合わせて免疫不全患者にとって深刻な脅威であり、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) のパンデミック以前には、造血幹細胞移植レシピエントにおけるウイルス性下気道感染症の大部分の原因となっていました 7,8。 他の危険因子を持つ成人の場合、HMPV およびパラインフルエンザ ウイルスによる疾患の負担も RSV9、10 に匹敵します。 さらに、ライノウイルスを除いて、RSV、HMPV、パラインフルエンザウイルスも合わせて、2020 年以前に入院中の成人で確認された呼吸器ウイルスの大部分を占めています11,12。

マスク、社会的距離、閉鎖などの新型コロナウイルス感染症パンデミック中の緩和戦略により、2020年から2021年の風邪とインフルエンザの季節には他の呼吸器ウイルスの感染者数は減少しましたが、RSV、HMPV、およびHPIVの感染者数は減少し始めています。再び急増し、今後数年間でパンデミック前の発行部数レベルに戻ると予想されています9,10。 実際、モデルでは、感染拡大が減少した期間後の感受性集団の規模の増加により、非 SARS-CoV-2 呼吸器ウイルスの大規模な将来の発生が予測されています 13。 さらに、風土病の呼吸器ウイルスは季節的に流行する傾向があるため、複数の呼吸器ウイルスによる同時感染が発生する可能性があり、脆弱な集団ではより悪い転帰と関連しています14、15、16。

中和モノクローナル抗体 (mAb) の投与は、ウイルス感染を防ぐためのワクチン接種に代わる効果的な手段となります。 抗 RSV mAb パリビズマブは、高リスク乳児の予防として 1998 年に FDA の承認を受けましたが 17、免疫力が低下した高齢の小児や成人では依然として比較的使用されていません。 パリビズマブの承認以来、高リスク乳児の予防のための標準治療としてパリ​​ビズマブに代わる主な目標を掲げ、RSV に対してさらに強力な mAb の開発が臨床試験を通じて進められてきました。 RSV が乳児の細気管支炎の最大 80% を引き起こすため、この問題が注目されるようになりました 18,19。 しかし、免疫不全の成人では、呼吸器ウイルスの状況はさらに不均一です7,8。 したがって、リスクのある成人や免疫不全患者における広範囲の下気道感染症による全体的な負担を軽減する効果的な戦略は、単一のウイルスではなく複数のウイルスを同時に標的にすることに依存する必要があります。 RSV 予防に関する研究の進歩にもかかわらず、他の呼吸器ウイルスに対する受動免疫の役割は依然として十分に定義されておらず、現在、HMPV、HPIV1、または HPIV3 感染を予防できる mAb は臨床で利用できません。

これらのウイルスに対する広範な防御を効率的に達成するために、一度に複数のウイルスを標的にできる交差中和 mAb を特定しようとしました。 RSV、HMPV、HPIV3、および HPIV1 はすべて、ウイルス侵入時にウイルスと宿主細胞膜間の融合を仲介することに特化した必須の表面糖タンパク質であるクラス I 融合 (F) タンパク質を生成します。 HPIV1 と HPIV3 は同じレスピロウイルス属に属しており、それらの F 配列は 65% のアミノ酸配列相同性を共有しています。 RSV と HMPV は同じニューモウイルス科に属しており、それらの F 配列は約 54% の相同性を共有します。 F タンパク質は、準安定な融合前 (preF) 立体構造と安定な融合後 (postF) 立体構造の間で遷移します 20,21。 preF は感染性ビリオンの主要な立体構造であるため、preF に対する抗体はウイルスを中和するのに最も強力である傾向があります 22、23、24、25。 RSV と同様に、融合前立体構造の HPIV3 および HPIV1 F タンパク質は、融合後立体構造と比較してより高い中和抗体力価を引き出します 26。 以前の研究では、安定化された HPIV3 preF タンパク質を使用して、HPIV327 に対するいくつかの中和抗体を同定および特性評価しました。 HMPV の場合、融合後立体構造を標的とする抗体も中和抗体力価に寄与しますが 28、HMPV 融合後 F は RSV に対する交差中和抗体を誘発しません 29。 本研究では、関連する F タンパク質間の相同性を利用し、それらの preF 立体構造に焦点を当てて、ヒト記憶 B 細胞から 2 つの強力な交差中和 mAb、3×1 および MxR を同定してクローニングしました。 3 × 1 は HPIV3 と HPIV1 の両方を交差中和しますが、MxR は HMPV と RSV の両方を効果的に交差中和します。 3 × 1 と MxR は一緒に、複数のウイルスに対する同時防御を達成する能力を備えた抗体カクテルを構成します。これは、呼吸器ウイルスに感染した場合に免疫学的に重大な不利な立場にあるリスクにさらされている集団にとって有益である可能性があります。

事実上すべてのヒトが RSV、HMPV、HPIV3、および HPIV130 に曝露されているため、血清陽性についてドナーを事前にスクリーニングする必要はありませんでした。 現在開発中のパラインフルエンザウイルスに対する mAb が不足しているため、我々はまず HPIV3/HPIV1 交差中和 B 細胞のスクリーニングに重点を置きました。 HPIV1 Fタンパク質をpreF立体構造で生成することができなかったため、このスクリーニングを行うために、ベイトアンドスイッチ戦略を活用してHPIV3のFタンパク質のみを使用しました（図1a、b）。 ここでは、アロフィコシアニン (APC) に結合した HPIV3 preF の四量体および APC/Dylight755 に結合した HPIV3 postF の四量体と 2 億個のヒト脾細胞をインキュベートし、その後抗 APC マイクロビーズで磁気濃縮することにより、HPIV3 結合 B 細胞を単離しました。 HPIV3 preF 四量体には結合するが、postF 四量体には結合しない 900 個の B 細胞を、CD40L/IL2/IL21 産生 3T3 フィーダー細胞を含むウェルに個別に選別し、培養上清への抗体分泌を刺激するために 13 日間インキュベートしました。 交差中和抗体を発現する候補B細胞を含むウェルを特定するために、個別に選別したHPIV3結合B細胞の培養上清を生きたHPIV1ウイルスと混合し、プラーク形成を減少させる能力についてスクリーニングしました（図1a、c）。 900個のHPIV3結合B細胞のうち2個が、HPIV1を中和できる抗体を産生しました（図1c）。 これらの細胞から、発現した重鎖 (VH3-23) および軽鎖 (Vλ3-19) 遺伝子の配列を決定し、クローン化することに成功し、HPIV3/HPIV1 に対する交差中和能力を持つ mAb を生成しました。これを 3 × 1 と名付けました (図 1b、 c)。 3 × 1 は、IgA アイソタイプを発現する B 細胞から単離されました。 呼吸器ウイルスに対して開発されているパリビズマブおよび他のほとんどの mAb は IgG1 定常領域を利用しているため、3 × 1 もクローニングされ、IgG1 としてさらなる研究のために生成されました。

単一の抗原を使用して、別の関連ウイルスを交差中和する B 細胞を特定するベイト アンド スイッチ アプローチ。 ヒト脾臓由来の HPIV3 結合 B 細胞を、HPIV3 preF の APC 結合四量体で標識しました。 b 生、CD3-CD14-CD16-CD19+CD20+ (B 細胞)、IgD-/IgM- (アイソタイプスイッチ)、および APC/Dylight755- HPIV3 postF- のゲーティング後の HPIV3 preF 結合 B 細胞のフローサイトメトリー プロット ( HPIV3 postF、APC、またはストレプトアビジンに結合する細胞を除外するため）。 結合画分には、APC 特異的マイクロビーズを使用して磁気的に濃縮された細胞が含まれています。 プロット上の数値は、ゲート内の総セルの割合です。 赤いボックスは、3 × 1 mAb が由来する B 細胞を示します。 c 中和スクリーニングからのウェルごとの HPIV1 プラークの頻度分布。 点線は、抗体の非存在下でウイルスを含むネガティブコントロールウェル内のプラークの平均数を示します。 赤いバーには、3×1 産生 B 細胞を含むウェルからのデータが含まれています。 d HPIV3 preFに対する3×1 IgG（上）およびFab（下）の結合動態を生物層干渉法（BLI）によって測定し、見かけの親和性（KD）を決定しました。 3 × 1 と HPIV3 preF をロードしたプローブとの結合を 300 秒間測定し、その後 1200 秒間解離を測定しました。 測定値はアイソタイプ対照抗体に対して正規化されます。 e Vero 細胞を、パリビズマブの段階希釈または 3 × 1 の存在下で HPIV3 または HPIV1 に感染させました。点線の正中線は PRNT60 を示します。 データポイントは、3 つの独立した実験からの平均 ± SD です。 パネル (a) は BioRender.com で作成されました。

HPIV1 の F タンパク質を preF 立体構造で安定化させることはできませんでしたが、3 × 1 と preF 立体構造の HPIV3 の F タンパク質の間の見かけの結合親和性を推定しました。 IgG として、3 × 1 は HPIV3 の preF タンパク質にしっかりと結合しました（KD < 10−12 M）（図 1d）。 3×1 Fabの結合親和性は急速な解離により低く（KD = 1.9×10−7 M）、結合を維持するには両方のFabによる同時結合が必要である可能性が高いことを示しています（図1d）。 3 × 1 の中和力は、Vero 細胞に感染する生ウイルスを使用した 60% プラーク減少中和試験 (PRNT60) によって決定されました。 3 × 1 は、HPIV1 と HPIV3 の両方に対して同様に高い中和能力を有し、PRNT60 はそれぞれ 352 ng/mL と 242 ng/mL でした（図 1e）。 さらなる調査により、3×1が細胞培養におけるHPIV3による細胞間拡散と合胞体の形成をブロックしたことが明らかになりました（図S1）。 これらの結果は、3 × 1 のエピトープが HPIV3 と HPIV1 の間で機能的に保存されている可能性を示唆しています。

HPIV3 preF の抗原状況は十分に特徴づけられていないため、最初に交差競合結合実験を実行して、中和を可能にする HPIV3 preF 上の抗原部位を測定しました。 交差中和 mAb 3 × 1 のエピトープは、preF の頂点に結合して HPIV3 を中和した、以前に単離した mAb のエピトープとは重複していないようでした (図 2a)27。 ただし、3 × 1 のエピトープは、サイト X27 と名付けた抗原部位に結合する以前に記載された抗体 PI3-A12 のエピトープと重複しているように見えました。 3 × 1 がサイト X とどのように相互作用するかを調べるために、cryo-EM を使用しました。 サンプル調製中に Fab が三量体よりもモル過剰であるにもかかわらず、多くの HPIV3 preF 三量体粒子には 3 つ未満の Fab が結合していました (図 S3a)。 3.62Åに分解されたHPIV3と複合体の1つのFabの構造を得ました（図S2aおよび表S1）。 また、HPIV3 に結合した 3 つの Fab の構造も得ました。 このマップは解像度 4.3 Å に制限されていました (図 S2a および S3a)。 C1 構造では、結合した preF プロトマーと結合していない preF プロトマー (360 Cα で RMSD = 0.721) の間に有意な変化は見られませんでした。 したがって、モデル構築には高解像度の構造を使用しました。 3×1はHPIV3 preFのドメインIIIに結合し、垂直に突き出て1つのプロトマーのみに結合し、他の領域と追加の接触はありません（図2b）。 6つのCDRのうち4つだけが結合に関与しており、CDRH1とCRDL2は糖タンパク質表面に接触するには短すぎる（図2c、d）。 3×1は、約812Å2の総埋め込み表面積（BSA）でサイトXに結合し、そのうちVHは約612Å2に寄与し、VLは約200Å2に寄与します（図2b、c）。 PI3-A12:HPIV3構造との比較により、3×1は同じ部位に結合するが、HPIV3 preFに対して回転していることが示されました（図S3b）。 3×1はHPIV3とHPIV1の両方を中和しますが、PI3-A12はHPIV327のみを中和し、3×1はPI3-A12とCDR配列の類似性をほとんど共有しません（図S3c）。 PI3-A12:HPIV3 複合体には高解像度の構造が存在しないため、3 × 1 LC が PI3-A12 LC または HC と重なるかどうかを判断できませんでした。 したがって、3×1とPI3-A12は、結合を促進する3×1の主要な残基で顕著な配列変異を示すため、HPIV3 preFの同じ部位内の異なるエピトープに結合する可能性があります（図S3c）。

チャートの左側にリストされている mAb が、上部にリストされている mAb の結合を防止する能力の BLI 測定。競合する mAb が存在しない場合の最大シグナルと比較した最大シグナルの低下パーセントとして表されます。 b HPIV3 preFと複合体を形成した3×1 FabのCryo-EM構造。 左は、3 × 1:HPIV3 マップの上から見た図で、1 つの Fab (VH は紫色、VL はピンク色で表示) と HPIV3 preF を灰色の色合いで示しています。 右は、複合体の表面表示を 90°回転させて示しており、1 つのプロトマー上でドメイン III が水色、ドメイン II が黄色で表示されています。 グリカンは緑色の球として表示されます。 c 生殖系列 VH および VL に対する 3 × 1 の配列アライメントの上に、preF プロトマーと相互作用する各 Fab 残基の BSA プロット。 d 漫画で示された相互作用する CDR のみを含む 3 × 1 結合部位の詳細図（60 回転） ° パネル (b) より。 ボックスはパネル (e) と (f) の位置を示します。 e パネル (b) から 40° 回転した CDRH3 結合部位の拡大図。 f パネル (b) から 110° 回転した CDRL3 結合部位の拡大図。 e、f HPIV3 preFと接触しないCDR残基は、明確にするために表示されていません。

マップの局所解像度をさらに分析すると、結合部位の解像度が全体の解像度 3.62 Å と比較して約 3.0 Å と高いことが示されました（図 S1a）。 3×1 VHとVLは一緒になって、HRAヘリックスとHPIV3の短い連続領域であるシートターンシートモチーフの間の裂け目を特異的に結合します（図S4a〜dおよびS5a、b）。 この領域はpreFからpostFへの再配置にとって重要であり、HRAヘリックスとシートターンシートモチーフの両方が再配置中に9Åを超える動きを示します26。 3×1はHPIV1上のHRAと相互作用する可能性が高いため、HRAはHPIV1の中和にも役割を果たしている可能性があります（図S4e）。 融合中にこの部位に必要な重要な運動と、RSV preF31 の中和エピトープとしてのその効力により、この位置での 3 × 1 結合は、3 × 1 の高い中和能に対する強力な構造的基盤を示します。 3×1は、非極性残基を使用してHPIV3 preFの表面の溝にいくつかの突起を形成します（図2d、e）。 His52AHC および Phe56HC (CDRH2) は、Leu100BHC および Leu100FHC (CDRH3) とともに、全 VH BSA の約 55% を占めます (図 2c)。 VH 内の他のほとんどの接触残基は極性残基であり、通常 <50 Å2 の BSA と接触します。 3×1のVL残基は、極性官能基とCDRループ骨格を使用してHPIV3 preFとの接触を形成し、CDRL1はHPIV3 preF上の大きな突起を取り囲んでいます（図2c、f）。 このCDRL1拡張は、Tyr31LCおよびLeu100FHCと接触するArg91LCによってサポートされており、Arg91LCはHPIV1に保存されているHPIV3 preFのAsp143と結合を形成します（図S5a〜cおよびS6a）。 また、3×1:HPIV3マップでは、フューリン切断後のF2タンパク質のC末端である可能性がある、あまり分解されていない特徴にも注目します（図S7a、b）。 この領域を構築するのに十分な密度はありませんが、3 × 1 結合部位に近いことは、追加の結合エピトープを示している可能性があります。

RSV と HMPV も脆弱な患者の疾患に大きく寄与しているため、次に、3 × 1 と組み合わせて幅が広がった強力なカクテルを作成できる可能性のある HMPV/RSV 交差中和 mAb を特定することに努めました。 RSV および HMPV を標的とする多くの mAb がすでに開発中ですが、蛍光四量体プローブを活用したアプローチを使用して、RSV および HMPV の組換え F タンパク質に preF 構造では結合できるが、postF 構造では結合できないユニークな B 細胞を同定しました。 APC に結合した RSV preF、R-フィコエリトリン (PE) に結合した HMPV preF、APC/DyLight755 に結合した RSV postF、および PE/DyLight650 に結合した HMPV postF を、磁気濃縮の前に 2 億個の末梢血単核球 (PBMC) と混合しました。抗PEおよび抗APCマイクロビーズ。 次に、RSV および HMPV の F タンパク質に結合する単一アイソタイプスイッチ B 細胞を preF 立体構造ではあるが postF 立体構造では分類せず、続いて単一細胞配列決定とそれらの B 細胞受容体のクローニングを行いました（図 3a）。 この方法を使用して、RSVとHMPVの両方に結合できるB細胞の重鎖（VH3-21）および軽鎖（Vλ1-40）対立遺伝子が配列決定され、MxRと名付けたmAbとしてクローニングされました（図3b）。 この B 細胞は IgG アイソタイプを発現しました。 3 × 1 と同様に、MxR はさらなる研究のためにクローン化され、IgG1 として生成されました。

a ヒト血液由来の RSV および HMPV 結合 B 細胞を、ビオチン化 RSV 融合前タンパク質 (preF) の APC 結合ストレプトアビジン テトラマーおよびビオチン化 HMPV preF の PE 結合ストレプトアビジン テトラマーで標識しました。 b 生、CD3-CD14-CD16- CD19+CD20+ (B 細胞)、IgD-/IgM- (アイソタイプスイッチ)、および APC/Dylight755- HMPV postF のゲート後の RSV および HMPV preF 結合 B 細胞のフローサイトメトリー プロット- および PE/Dylight650-RSV postF- (RSV/HMPV postF、APC、PE、またはストレプトアビジンに結合する細胞を除外するため)。 結合画分には、APC および PE 特異的なマイクロビーズを使用して磁気的に濃縮された細胞が含まれています。 プロット上の数値は、ゲート内の総セルの割合です。 赤いボックスは、MxR mAb の由来となる B 細胞を示します。 c BLI によって測定された MxR、MPE8、および D25 の見かけの親和性 (KD)。 d Vero細胞を、パリビズマブ（パリ）、D25、MPE8、またはMxRの段階希釈物の存在下でRSV-A、RSV-B、またはHMPVに感染させた。 データ点は、60% プラーク減少中和力価を表し、3 つの独立した実験からのものです。 アスタリスクは、ウェルチ補正を使用した両側 t 検定を使用した ap < 0.05 を示します。 アスタリスクの隣の数字は正確な p 値を示します。 パネル (a) は BioRender.com で作成されました。

我々は、乳児の RSV 予防用にニルセビマブの名前で開発されている RSV 特異的モノクローナル抗体 D25 に対する MxR の見かけの結合親和性を比較しました 32,33。 RSV には、抗原的に異なる 2 つのサブタイプ、A および B があり、F タンパク質内で 91% のアミノ酸配列相同性を共有します。 MxRは、解離時間が1200秒に延長された場合でも、RSVサブタイプAおよびBの両方のpreFタンパク質に高い見かけの親和性で不可逆的に結合しました（それぞれKD < 10-12 M）（図3cおよびS8a、d）。 以前に報告された交差中和モノクローナル抗体MPE834も、RSVサブタイプAおよびBの両方に対して高い見かけの親和性を示しました（図3cおよびS8b、e）。 D25はRSVサブタイプBのpreFタンパク質にも強く結合しましたが、サブタイプAへの結合と比較して見かけの親和性（KD = 1.5×10−9 M）が約1500倍低かった（図3cおよびS8c、f）。 ＭｘＲは、ＨＭＰＶのｐｒｅＦタンパク質にも結合することができた（図３ｃおよびＳ８ｇ）。これは、選別中にＲＳＶとＨＭＰＶの両方に結合するＢ細胞を意図的に選択したことを考慮すると予想されたことである。 MPE8と比較して、HMPVに対するMxRの見かけの結合親和性は約1.6倍強かった(図3cおよびS8g、h)。

RSV の両サブタイプは世界中で循環しているため、サブタイプ A および B に対する MxR の中和能（PRNT60）を評価することが重要でした。また、MxR の中和能を、現在 RSV に対して承認されている RSV 特異的モノクローナル抗体パリビズマブと比較しました。高リスクの乳児の予防。 我々は、MxRがパリビズマブと比較して少なくとも6倍高い効力でRSVサブタイプAを中和することを発見した（図3dおよびS9a）。 両方のサブタイプに対して同様の効力を有するパリビズマブ 35 とは対照的に、MxR はサブタイプ B に対しても非常に強力であり、その効力は 12 倍でした (図 3d および S9b)。 D25はRSV-Aに対してより優れた中和能力を持っていましたが（図3d）、D25は一部のRSV-B株に対して能力が弱く、HMPV36、37、38を中和しないと報告されています。 MxR と MPE8 は、RSV サブタイプ A と B の両方の中和において同様の効力を持っていました。 ただし、MxR は HMPV に対して少なくとも 5 倍高い効力を持ち、PRNT60 は MPE8 の 838 ng/mL と比較して 148 ng/mL でした（図 3d およびS8c)。 生ウイルスの60％を中和するのに必要な抗体の濃度に基づくと、HMPVに対するMxRの効力は、RSVに対するパリビズマブの相対的な効力を上回りました（図3d）。

MxRで観察された交差中和の基礎をよりよく理解するために、RSV preFに結合した3つのMxR FabのクライオEM構造を2.24Åの解像度で取得しました（図S2b、S10、および表S1）。 ＭｘＲは、ＲＳＶ ｐｒｅＦの周囲にＦａｂが赤道状に配置されて、主にＲＳＶ上の抗原部位ＩＩＩに結合する。 抗原部位IIIは、1つのFプロトマーのドメインIおよびIIIと、時計回りに隣接するFプロトマーのドメインII（II'と呼ばれる）の接合部にある四級エピトープである（図4a）。 MxR は合計約 1094 Å2 の BSA で結合し、VH は約 694 Å2 に寄与し、VL は約 400 Å2 に寄与し、そのうち約 298 Å2 が主要な F プロトマーと接触し、約 102 Å2 が隣接する F プロトマーと接触します。 私たちの構造は、FabとpreFプロトマー間の相互作用を潜在的に媒介する結合部位全体に間隔を置いて配置された多数の水分子を明らかにしました（図S11）。 わかりやすくするために、これらは図 4 から省略されています。 結合様式は、以前に報告された交差中和モノクローナル抗体 MPE834 および乳児用モノクローナル抗体 ADI-1942539 とほぼ同一であり、これらは同じ生殖系列重鎖 (IGHV3-21*01) および軽鎖 (IGLV1-40*01) に由来します。 ) 対立遺伝子。 MxR、MPE8、およびADI-19425と複合体を形成したRSV preFの残基ごとのBSAを比較すると、HMPVと高い配列相同性を共有する共通の結合領域が明らかになりました（図S6b）。 CDR1とCDR2の両方の配列と構造は3つの抗体すべてでほぼ同一であり、MxR全体では他の2つよりも生殖系列からの変異が多くなっています（図4b、c）。

a 左には、DeepEMhanced MxR:RSV クライオ EM マップの上から見た図が示されており、MxR VH は濃い赤色、MxR VL は薄い赤色、RSV preF は灰色の色合いで示されています。 Fab の Fv ドメインのみが表示されます。 右は、構造の表面表現を 90 度回転して示しています。 1 つの preF プロトマーはその構造ドメインごとに色付けされており、1 つの MxR Fv は漫画の輪郭で示されています。 時計回りに隣接するプロトマーの DII ドメインは淡いピンク色で、紫色に着色された他のプロトマーの DII と区別するために DII' と指定されています。 グリカンは緑色の球として表示されます。 (b) 生殖系列 V 遺伝子の配列アラインメント上の、RSV preF と相互作用する MxR、MPE8、および ADI-19425 残基の BSA プロット。 文字 H は水素結合を示します。 S という文字は塩橋を示します。 色付きのボックス内の残基は、パネル (d および e) に示されている残基に対応します。 c MxR、MPE8、およびADI-19425のCDRを重ね合わせて漫画で示した、RSV preF上の結合部位の詳細図。 MPE8 は緑色、ADI-19425 は青色で透明で表示されます。 抗原部位 III は白い輪郭で描かれています。 d パネル(c)から反時計回りに30°回転したCDRH3結合部位の拡大図。 e パネル(c)から時計回りに65°回転したCDRL3結合部位の拡大図。 最初の 4 残基は、明瞭さを増し、抗体間の CDRL3 の類似性を示すためにのみ主鎖として示されています。

MxR、MPE8、および ADI-19425 の CDRH3 領域は、すべての結合が抗原部位 III 内の DI/DII'/DIII 界面付近にあるにもかかわらず、配列と構造の多様性が大きく、保存された残基がほとんどありません。 この界面には小さな裂け目があり、そこにCDRH3ループがさまざまな程度で伸びています(図4c、d)。 MPE8 CDRH3 が最も長く、MxR が最も短く、ADI-19425 はその中間の長さです。 特に、ADI-19425 はこのループを安定化するためにジスルフィド結合を使用しますが、MPE8 と MxR にはこの結合がありません (図 4d)34,39。 ジスルフィド結合によって課せられた剛直な形状により、ADI-19425 の HMPV への結合能力が損なわれる可能性があります。 したがって、抗原部位IIIの裂け目内に結合するための正しいループ形状を形成する際のMPE8 CDRH3の必要性は、MxRと比較してMPE8によるHMPVの中和低下の背後にある構造的基盤である可能性があります（図4c、d、および3d）。 CDRH3がMPE8よりも比較的短いため、MxRはDII'に接触せずにこの裂け目に結合するため、結合を促進するための拡張ループを必要としません（図4dおよびS6b）。 MxR の CDRL2 のみが DII' と接触します (図 4c)。 CDRがHMPVプロトマーに重ねられると、一般的な結合部位は非常に類似しており、同様の抗原部位の寄与と残基の同一性を含むことがわかります（図S12a、b）。 ただし、利用可能な結合裂け目はより狭くて短いため、ADI-19425 および MPE8 CDRH3 ループが立体的に妨げられる可能性があります (図 S12c)。 CDRL3 は、相互作用する残基にも多少の変化を示します（図 4e）。 MPE8とMxRは両方とも、ADI-19425とは共有していない93LC位の塩基性残基を共有しており、3つの抗体すべてが残基94〜96LCでわずかに異なるループ配置を示します（図4e）。 ただし、CDRL3 の結合モードは類似しているように見えますが、CDRH3 に見られる独特の特徴はありません。

次に、in vitro の結合および中和データが動物攻撃モデルにおける in vivo の保護に反映されるかどうかを調査しました。 ヒトパラインフルエンザウイルスはマウスでは複製しませんが、ハムスターとコットンラットの両方で上気道および下気道の複製が証明されています30,40。 RSV については、ハムスターとコットンラットの肺で同等のウイルス力価が報告されています 41。 いくつかの研究では、ハムスターと比較してコットンラットの肺でHMPVの力価が高いことが観察されていますが42,43、これは使用したウイルス株、接種材料のサイズ、および肺サンプリングのタイミングの違いに関連している可能性があります。 ハムスター モデルは、パラインフルエンザ ウイルス、RSV、および HMPV44、45、46、47、48、49、50、51、52 ​​のワクチン候補を評価するために広く使用されています。 この研究のすべてのウイルスはハムスターで複製できるため44、45、51、53、54、55、56、57、ゴールデンシリアンハムスターモデルでMxRと3×1の前臨床試験を実施しました。 感染予防としてのモノクローナル抗体の有効性を評価するために、-2日目にハムスターに筋肉内注射を行い、0日目にハムスターの鼻腔内に感染させ、感染後5日目に肺と鼻甲介を採取しました（図5a）。 この投与量、経路、および投与のタイミングは、RSV 感染のコットンラットモデルで使用されるものと類似しています 41,58,59。 パリビズマブをベンチマークとして使用し、HPIV3 に対して 3 × 1、RSV に対して MxR で用量設定実験を実行しました。 ハムスターに 5 mg/kg の用量を筋肉内注射して 2 日後、5.1 ～ 9.7 μg/mL の mAb 血清濃度が観察されました (図 5b)。 5 mg/kg の用量で、MxR と 3×1 は、それぞれ肺における HPIV3 と RSV のウイルス複製を完全に抑制しました（図 5c、d）。 対照的に、パリビズマブとMxRはRSVに対して同様のEC90を有していたにもかかわらず、5 mg/kgのパリビズマブは肺におけるウイルス複製を完全には抑制しなかった（図5d、e）。 これは、5 mg/kg のパリビズマブによる画期的感染も観察されたコットン ラット モデルからのデータと一致しています 60。 5 mg/kg で 3 × 1 を予防的に投与しても、鼻甲介の複製にはほとんど影響がありませんでした (図 5c)。 しかし、5 mg/kgのMxRの予防的投与は、鼻甲介におけるRSV複製を47倍以上減少させた(図5d)。 これは、鼻甲介における RSV 複製に影響を及ぼさなかったパリビズマブとは対照的です。 5 mg/kg 用量は RSV および HPIV3 のウイルス複製を抑制したため、この用量を HPIV1 および HMPV についてもテストしました。 HPIV1複製は、1匹を除くすべての動物の肺で完全にブロックされ、3×1予防を受けたハムスターの鼻甲介では大幅に減少しました（図5f）。 MxR予防を受けたハムスターの肺では、HMPV複製が206倍を超えて大幅に減少しました（図5g）。

a 105 pfuのウイルスによる鼻腔内攻撃の2日前にハムスターに3×1またはMxRを筋肉内注射した実験の概略図。 b 5、2.5、および1.25 mg/kgでmAbを投与した2日後の3×1およびMxRの血清濃度をELISAによって測定しました（n = 4動物/用量）。 HPIV3およびRSV複製に対する3×1（c）およびMxR（d）の用量反応（n = 5実験動物/用量/ウイルス、n = 5対照動物の鼻甲介/ウイルス、およびn = 4対照動物の肺） /ウイルス）。 e 用量反応実験に基づく、RSV に対するパリビズマブの 90% 有効濃度 (EC90)、RSV に対する MxR、および HPIV3 に対する 3 × 1。 f HPIV1および（g）5 mg / kgで3×1またはMxRを注射した後のHMPV複製（HPIV1の2つの独立した実験にわたるn = 8動物/グループ、およびn = 10動物の鼻甲介/グループ、n = 10） HMPV の 2 つの独立した実験にわたる実験動物の肺、および n = 7 の対照動物の肺）。 ウイルス力価は、感染後 5 日目に個々のハムスターからの肺および鼻のホモジネートのプラークアッセイによって測定されました。 破線は検出限界を示します。 棒は平均を表し、星印は、1× DPBSを注射した対照ハムスターと比較したマン・ホイットニー検定による両側p < 0.05を示します。 アスタリスクの隣の数字は正確な p 値を示します。 パネル (a) は BioRender.com で作成されました。

MxR と 3 × 1 をカクテルとして一緒に投与すると、HMPV、RSV、HPIV3、および HPIV1 に対して広範な保護を提供できます。 造血幹細胞移植レシピエントにおける重篤な呼吸器ウイルス感染症の大部分は 4 つのウイルスすべてが原因であるため、これは臨床的に重要です。 4 つの mAb (ウイルスごとに 1 つ) の同時投与と比較して、4 つのウイルスを標的とするために 2 つの mAb を使用すると、より高用量の各 mAb を投与できるため、毒性を最小限に抑えながら有効性を最大化できます。 混合感染は免疫不全患者の転帰不良と関連している可能性があるため、カクテルの投与は複数の呼吸器ウイルスによる同時感染の場合にも役立つ可能性があります 16。 したがって、我々は、MxR と 3 × 1 を一緒に同時投与した場合の有効性を評価するために、ハムスターにおける HPIV3/RSV 同時感染モデルを開発しました。 ウイルス力価を決定するプラークアッセイでは HPIV3 と RSV を区別できなかったため、リアルタイム PCR によって個々のウイルス量を定量するためのカスタム TaqMan プローブを開発しました。 まず、これらのウイルスの一方または両方に感染した動物の肺で検出された HPIV3 と RSV のレベルを比較しました。 RSV と他のウイルスの同時感染は RSV 力価に影響を及ぼさないことを示唆するヒト研究のデータ 61 と同様に、同量の RSV と HPIV3 を同時に接種した動物の肺におけるウイルス複製の減少は観察されませんでした。単一のウイルスを接種された動物へ（図6a、b）。

RSV および HPIV3 をそれぞれ 105 pfu ずつ同時感染させたハムスターの肺ホモジネート中の HPIV3 (a) および RSV (b) の比ウイルス量を、リアルタイム PCR によって 105 pfu の単一ウイルスに感染させたハムスターと比較しました。 4 匹の動物/単一感染、および同時感染の場合は n = 6。 c 各105 pfuのHPIV3およびRSVによる鼻腔内チャレンジの2日前に、カクテルとして3×1およびMxRをそれぞれ5 mg / kgをハムスターに筋肉内注射した実験の概略図。 肺および鼻組織ホモジネート中の HPIV3 (d) および RSV (e) の特異的ウイルス量を、それぞれ HPIV3 および RSV 特異的プライマーを使用したリアルタイム PCR によって決定しました。 HPIV3 の場合: 2 回の独立した実験にわたって、n = 8 匹の動物の鼻甲介/グループ、n = 8 匹の実験動物の肺、および n = 7 匹の対照動物の肺。 RSV の場合: 2 回の独立した実験で n = 7 匹/グループ。 f 感染後5日目の肺および鼻のホモジネートにおけるプラークアッセイによる全体的なウイルス力価（2回の独立した実験にわたるn = 7動物/グループ）。 破線は検出限界を示し、バーは平均を示し、アスタリスクは対照ハムスターと比較したマン・ホイットニー検定による両側 p < 0.05 を示します。 アスタリスクの隣の数字は正確な p 値を示します。 ns は有意でないことを示します。 パネル (c) は BioRender.com で作成されました。

次に、-2日目にMxRと3×1のカクテルをハムスターに筋肉内注射し、0日目にハムスターにHPIV3とRSVを同時感染させ、感染後5日目に肺と鼻甲介を採取しました（図6c）。 抗体のカクテルは、鼻甲介におけるHPIV3複製には影響を及ぼさなかったが、肺におけるウイルス量を88倍を超えて実質的に減少させた(図6d)。 抗体のカクテルは、肺および鼻甲介におけるRSVウイルス量をそれぞれ17倍および2.9倍以上特異的に減少させ、ハムスター7匹中4匹の肺におけるRSVは検出限界を下回りました（図6e）。 プラークアッセイを使用すると、抗体のカクテルは、肺におけるHPIV3とRSVの複合ウイルス複製を7匹中6匹の動物で検出不可能なレベルまで、そして鼻甲介では6倍以上大幅に減少させました（図6f）。

我々は、2 つの抗ウイルス交差中和モノクローナル抗体を単離しました。HPIV3 と HPIV1 を標的とする 3 × 1。 RSV と HMPV をターゲットとする MxR です。 これら 2 つの抗体を組み合わせると、造血幹細胞移植患者やその他の脆弱な集団を苦しめる 4 つの主要な呼吸器ウイルスに対して同時に広範囲の防御を提供できる可能性があります。 このため、我々は、あるウイルスに結合し、同時に別のウイルスを中和できる B 細胞は、両方のウイルスを交差中和する可能性が高いという理論的根拠に基づいた、おとりスイッチ戦略を開発しました。 この戦略は、複数のパラインフルエンザ ウイルスを中和するモノクローナル抗体 3 × 1 の発見につながりました。 おとりスイッチ戦略は、すべての抗原が既知または入手できるわけではない状況で、他の病原体に対する交差中和抗体を同定するための一般的に有用なアプローチである可能性もあります。 また、磁気濃縮と細胞選別を使用して、preF 構造の組換え融合タンパク質に特異的に結合できるが postF 構造には結合できない希少な B 細胞を単離しました。 さらに、CD40L、IL2、およびIL2127,62を発現するフィーダー細胞を利用して、培養中の個々のB細胞からの抗体産生を刺激しました。 これらの技術を組み合わせることで、交差中和のための B 細胞のハイスループットな単離とスクリーニングが可能になりました。

相同ウイルス間で機能的に保存されたエピトープを標的とすることは、エスケープ変異の出現による薬剤耐性発症のリスクを軽減する魅力的な戦略です。 そして同時に、より広範な病原体から保護することで、暴露前予防の利益を高めることができます。 交差中和 3 × 1 mAb は、融合前 F 三量体の頂点上の赤道と頂点の間に位置する HPIV3 preF 上の部位 (サイト X と呼びます) に結合します。 3 × 1 は HPIV3 のフリン切断部位、特に F2 タンパク質の C 末端に結合する可能性がありますが、この領域は効果的にモデル化するには無秩序すぎます。 系統発生的に関連したウイルスを交差中和する抗体は、よく保存されたエピトープを標的とする傾向があります 63。 3 × 1 の重鎖上の非極性突起と表面の溝との間の相互作用は、HPIV3 と HPIV1 の両方への結合を可能にする 1 つのメカニズムを表す可能性があります。 さらに、3×1の軽鎖はHPIV3 preF上の大きな突起を取り囲み、Asp143で水素結合を形成しており、これはHPIV1に保存されている。 3 × 1 は、HPIV3 と HPIV1 の両方の HRA ヘリックスに結合すると考えられます。このヘリックスは、F タンパク質が preF 構造から postF 構造に移行する際に、融合中に重要な動きを受ける部位です。 HPIV1 の 3 × 1 中和を媒介する分子相互作用をより深く理解するには、さらなる構造解析が必要となります。

MxR mAb は HMPV と RSV の両方を中和し、同等の結合様式をもたらす顕著な配列類似性を含む、別の抗体 MPE814,34 と顕著な類似性を共有します。 ただし、MxR はより体細胞超変異抗体であり、MPE8 に見られる拡張された CDRH3 を持たずに部位 III 認識を促進するため、エネルギー的により有利な部位認識が得られる可能性があります。 この構造の違いは、HMPV の中和において MxR と MPE8 の間で観察された違いの基礎となっている可能性があり、MxR は約 5.7 倍高い効力を持っています。

パリビズマブは現在、高リスク乳児の RSV 予防用として FDA に承認された唯一の抗体です。 しかし、パリビズマブによる防御は RSV に限定されているため、HMPV、HPIV3、HPIV1 などの他のウイルスが疾患に大きく関与している免疫不全状態の小児や成人には広く使用されていません 64。 したがって、MxR と 3 × 1 のカクテルは、より広範な保護薬に対するこの満たされていないニーズを満たす可能性があります。 パリビズマブに代わるニルセビマブとして開発されている RSV 特異的 D25 モノクローナル抗体の臨床適応も同様に乳児に焦点を当てています 33。 我々および他の研究者は、RSV サブタイプ A と比較して RSV サブタイプ B の preF タンパク質への D25 の結合が減少していることを観察しました [図 5]。 3c; 参照も参照してください。 65]。 ニルセビマブ 32 の投与後に RSV サブタイプ B の画期的感染を起こした乳児で D25 へのエスケープ変異が確認されているため、これは注目に値します。 RB1 は臨床開発中の別の抗体で、RSV-A および RSV-B に対して同等の効力を持ちますが、HMPV35 は中和しません。 本研究で我々が記載する交差中和MxR抗体は、RSVサブタイプAとBの両方のpreFタンパク質に強く結合し、HMPVも中和する。 臨床的に発生する可能性のある潜在的なエスケープ変異とウイルス複製に対するその適応コストの分析は、MxR と 3 × 1 の開発における重要な次のステップです。

RSV、HMPV、HPIV3、および HPIV1 から保護するために MxR と 3 × 1 のカクテルを投与する潜在的な臨床的有用性を調査するために、免疫予防に関する in vivo 有効性研究に焦点を当てました。 新型コロナウイルス感染症（COVID-19）のパンデミックの中で、脆弱な人々の呼吸器ウイルス感染症を予防することの重要性がますます明らかになりました。 Evusheldとして販売されている2つのSARS-CoV-2特異的モノクローナル抗体のカクテルは、ワクチン接種に対する反応が乏しいと予想される免疫不全患者の予防としてFDAによって認可された。 第III相試験では、総抗体量600mgとしてエヴスヘルドを筋肉内投与すると、症候性の新型コロナウイルス感染症（COVID-1966）の相対リスクが83％減少した。 オーミクロン変異体にエスケープ変異が存在するため、FDA は抗体総量 1200 mg に用量を修正しました。これは、体重 60 kg の個体の場合、20 mg/kg の用量に相当します。 私たちの in vivo 有効性研究では、同様に 2 つの抗体 MxR および 3 × 1 のカクテルをそれぞれ 5 mg/kg で合計 10 mg/kg 用量で投与しました。 したがって、本研究で試験された用量は、すでに臨床使用されている他の抗体の範囲内であり、将来の人体研究では用量を増やす余地が残されている。 MxR と 3 × 1 は、非常に脆弱な患者集団における広範な呼吸器ウイルス感染症から保護するためのさらなる開発のための有望な mAb 候補となります。

この研究は、関連するすべての倫理規制に準拠しており、フレッド・ハッチンソンがんセンター治験審査委員会によって審査および承認されました。 末梢血は、シアトル地域対照研究に登録された健康な HIV 血清陰性の成人ボランティアから、インフォームドコンセント (プロトコル #5567) の後、静脈穿刺によって採取されました。 PBMC は、Accuspin System Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich、カタログ番号 10771) を使用して全血から単離されました。 ヒトの脾臓に関する研究は、組織が匿名化されていたため、非ヒト被験者の研究とみなされました。 脾臓サンプルは、フレッド・ハッチ治験審査委員会によって、またヒト研究保護局の共通規則によって定義されているように、非ヒト被験者の研究とみなされます。 組織は匿名化され、提供のために他の臓器（肝臓など）を調達する際に脾臓が廃棄されるはずだった死亡したドナーに由来するものでした。 組織断片をバスケットスクリーンに通し、300×gで7分間遠心分離し、ACK溶解バッファー（Thermo Fisher、カタログ番号A1049201）とともに3.5分間インキュベートし、RPMI（Gibco、カタログ番号11875093）に再懸濁し、フィルターを通過させました。 500 µm と 70 µm のセルストレーナーを積み重ねたもの。 細胞を、熱不活化ウシ胎児血清（Gibco、カタログ番号16000044）中の10％ジメチルスルホキシドに再懸濁し、使用前に液体窒素中で凍結保存した。

293F 細胞 (Thermo Fisher、カタログ番号 R79007) を Freestyle 293 培地 (Thermo Fisher、カタログ番号 12338026) で培養しました。 Vero 細胞 (ATCC CCL-81)、LLC-MK2 細胞 (ATCC CCL-7.1)、および HEp-2 (ATCC CCL-23) を、10% ウシ胎児血清および 100% を添加した DMEM (Gibco、カタログ番号 12430054) で培養しました。 U/mL ペニシリンと 100 μg/mL ストレプトマイシン (Gibco、カタログ番号 15140122)。 HEp-2 は HeLa 細胞の汚染により誤って識別されることが多い細胞株ですが (iclac.org/databases/cross-contaminations/)、HEp-2 は伝統的に RSV を高力価まで増殖させるために使用されています。

組換えウイルス RSV-GFP、HMPV-GFP、HPIV1-GFP、および HPIV3-GFP は以前に記載されており 46、67、68、69 、それぞれ RSV 株 A2 (GenBank アクセッション番号 KT992094)、HMPV CAN97-83 から改変されました。 (GenBank アクセッション番号 AY297749)、HPIV1/Washington/20993/1964 (GenBank アクセッション番号 AF457102)、および HPIV3 JS (GenBank アクセッション番号 Z11575) を使用して、強化された GFP を発現します。 RSV サブタイプ B 株 18537 (GenBank アクセッション番号 MG813995) は ATCC (カタログ番号 VR-1580) から入手しました。 RSV サブタイプ B 株 B1 (GenBank アクセッション番号 AF013254.1) は、ViraTree (カタログ番号 RSVB-GFP3) から入手しました。 HMPV、HPIV1、および HPIV3 は LLC-MK2 細胞で培養され、RSV は HEp-2 細胞で培養されました。 ウイルスを、0.05 M HEPESおよび0.1 M MgSO4 (それぞれSigma-Aldrich、カタログ番号H4034および230391)を使用した不連続30%/60%スクロース勾配中、120,000×g、4℃で90分間遠心分離することによって精製しました。 ウイルス力価は、0.8％メチルセルロースを含むDMEM（Sigma-Aldrich、カタログ番号M0387）を重層したウイルスの10倍段階希釈物を24ウェルプレート中のVero細胞単層に感染させることによって測定した。 ＨＰＩＶ１およびＨＭＰＶを含むアッセイでは、０．０５％のうち１．２％のトリプシン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２５３０００５４）が培地に含まれた。 感染後 5 日目に、Typhoon スキャナー (GE Life Sciences) を使用して蛍光プラークを計数しました。

His タグ付き RSV、HMPV、および HPIV3 preF および postF 抗原の発現プラスミドは以前に記載されています 26、70、71。 293F 細胞を、1 mg/mL PEI Max (Polysciences、カタログ番号 24765) を使用して、Freestyle 293 培地中で 106 細胞/mL の密度でトランスフェクトしました。 トランスフェクトされた細胞は、37 °C で穏やかに振盪しながら 7 日間培養されました。 培養物を2500×gで30分間遠心分離し、続いて0.2μMフィルターで濾過することによって上清を回収した。 清澄化した上清をNi Sepharoseビーズとともに4℃で一晩インキュベートし、続いて50 mM Tris、300 mM NaCl、および8 mM イミダゾールを含む洗浄緩衝液で洗浄しました。 Hisタグ付きタンパク質は、25 mM Tris、150 mM NaCl、および500 mM イミダゾールを含む溶出バッファーで溶出しました。 精製したタンパク質を 10/300 Superose 6 サイズ排除カラム (GE Life Sciences、カタログ番号 17-5172-01) に通しました。 三量体 F タンパク質を含む画分をプールし、50 kDa Amicon 限外濾過ユニット (Millipore、カタログ番号 UFC805024) での遠心分離によって濃縮しました。 濃縮サンプルは 50% グリセロール中で -20 °C で保存されました。

精製した F 抗原を、EZ-link Sulfo-NHS -LC-Biotinylation キット (Thermo Fisher、カタログ番号 A39257) を使用し、ビオチンと F のモル比 1:1.3 でビオチン化しました。非結合ビオチンは、50 kDa Amicon Ultra を使用した遠心分離によって除去しました。サイズ排除カラム (Millipore)。 F の各分子に結合するビオチン分子の平均数を決定するために、ストレプトアビジン-PE (ProZyme、カタログ番号 PJRS25) を一定量のビオチン化 F に漸増濃度で滴定し、室温で 30 分間インキュベートしました。 サンプルを SDS-PAGE ゲル (Invitrogen、カタログ番号 NW04127BOX) 上で泳動し、ニトロセルロースに移し、1:10,000 希釈のストレプトアビジン – Alexa Fluor 680 (Thermo Fisher、カタログ番号 S32358) とインキュベートして、ストレプトアビジンと Alexa Fluor 680 試薬が結合するために利用できる過剰なビオチンがありました。 ビオチン化 F をストレプトアビジン - アロフィコシアニン (APC) またはストレプトアビジン - PE と上記で決定した比率で混合し、ストレプトアビジンを完全に飽和させ、室温で 30 分間インキュベートしました。 結合していないＦを、３００Ｋ Ｎａｎｏｓｅｐ遠心分離装置（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号ＯＤ３００Ｃ３３）を使用する遠心分離によって除去した。 APC/DyLight755 および PE/DyLight650 四量体は、F と、それぞれ DyLight755 と事前に結合したストレプトアビジン – APC (Thermo Fisher、カタログ番号 62279) または DyLight650 と事前に結合したストレプトアビジン – PE (Thermo Fisher、カタログ番号 62266) とを混合することによって作成されました。メーカーの指示に従ってください。 平均して、APC/DyLight755 および PE/DyLight650 には、APC および PE あたり 4 ～ 8 個の DyLight 分子が含まれていました。 各四量体の濃度は、APC (650 nm、吸光係数 = 0.6 μM-1 cm-1) または PE (566 nm、吸光係数 = 2.0 μM-1 cm-1) の吸光度を測定することによって計算されました。

1 ～ 2 × 108 個の凍結 PBMC または 4 ～ 8 × 107 個の凍結脾臓細胞を、10% ウシ胎児血清および 100 U/mL ペニシリンと 100 μg/mL ストレプトマイシンを含む DMEM に解凍しました。 細胞を遠心分離し、リン酸緩衝食塩水 (PBS) と 1% 新生子牛血清 (Thermo Fisher、カタログ番号 26010074) で構成される氷冷蛍光活性化細胞選別 (FACS) 緩衝液 50 μL に再懸濁しました。 PostF APC/DyLight755 および PE/Dylight650 結合四量体を、2% ラットおよびマウス血清 (Thermo Fisher) の存在下で最終濃度 25 nM で添加し、室温で 10 分間インキュベートしました。 次いで、ＰｒｅＦ ＡＰＣおよびＰＥ四量体を最終濃度５ｎＭで添加し、氷上で２５分間インキュベートし、続いて氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で１０ｍＬ洗浄した。 次に、抗 APC 結合 (Miltenyi Biotec、カタログ番号 130-090-855) および抗 PE 結合 (Miltenyi Biotec、カタログ番号 130-048-801) マイクロビーズをそれぞれ 50 μL 加え、氷上で 30 分間インキュベートしました。分後、３ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、混合物を磁化ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０４２－４０１）に通した。 カラムを５ｍＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、その後磁場から外し、プランジャーを使用して５ｍＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液を磁化されていないカラムに２回押し込み、結合細胞画分を溶出した。

細胞を、洗浄およびＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ）での分析の前に、抗体のカクテルを含む５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中で氷上で３０分間インキュベートした。 抗体には、抗 IgM FITC (G20–127、BD、カタログ番号 555782、1:80 希釈)、抗 CD19 BUV395 (SJ25C1、BD、カタログ番号 563551、1:20 希釈)、抗 CD3 BV711 (UCHT1、BD) が含まれます。 、カタログ番号 563725、1:50 希釈)、抗 CD14 BV711 (M0P-9、BD、カタログ番号 563372、1:50 希釈)、抗 CD16 BV711 (3G8、BD、カタログ番号 563127、1:50 希釈) 、抗 CD20 BUV737 (2H7、BD、カタログ番号 612849、1:20 希釈)、抗 IgD BV605 (IA6–2、BD、カタログ番号 563313、1:50 希釈)、抗 CD27 PE/Cy7 (LG. 7F9、eBioscience、カタログ番号 25-0271-82、1:160 希釈）、および固定可能な生存率色素（Tonbo Biosciences、カタログ番号 13-0870-T500、1:250 希釈）。 B 細胞を、1) 空の 96 ウェル PCR プレートに個別に選別し、直ちに凍結するか、2) 100 µL の10% ウシ胎児血清、100 U/mL ペニシリンと 100 μg/mL ストレプトマイシン、および 2.5 μg/mL アンホテリシンを含む IMDM 培地 (Gibco、カタログ番号 31980030)。 フィーダー細胞上に選別された B 細胞を 37 °C で 13 日間培養しました。

選別され、空の 96 ウェル PCR プレートに凍結された個々の B 細胞については、プレートを解凍した後、SuperScript IV (Thermo Fisher、カタログ番号 18090200) を使用して逆転写 (RT) を直接実行しました 72,73。 簡単に説明すると、3 μL の 50 μM ランダム六量体 (Thermo Fisher、カタログ番号 48190011)、0.8 μL の 25 mM デオキシリボヌクレオチド三リン酸 (dNTP、Thermo Fisher、カタログ番号 N8080261)、1 μL (20 U) SuperScript で構成される 3 μL RT 反応ミックスです。 IV RT、0.5 μL (20 U) RNaseOUT (Thermo Fisher、カタログ番号 10777019)、0.6 μL の 10% Igepal (Sigma-Aldrich、カタログ番号 I8896)、および 15 μL RNase フリー水を、単一のウェルを含む各ウェルに添加しました。 B 細胞を選別し、50 °C で 1 時間インキュベートしました。 フィーダー細胞上に選別された個々の B 細胞については、13 日間の培養後に上清を除去し、プレートをドライアイス上で直ちに凍結し、-80 °C で保存して解凍し、RNeasy Micro Kit (Qiagen、カタログ番号) を使用して RNA を抽出しました。 74034）。 RNA 抽出からの溶出液全体を RT 反応で水の代わりに使用しました。 RT 後、最終反応液に 0.2 μL (0.5 U) HotStarTaq ポリメラーゼ (Qiagen、カタログ番号 203607)、0.075 μL の 50 μM 3' リバースプライマー、0.115 μL の50 μM 5' フォワード プライマー、25 mM dNTP 0.24 μL、10 × バッファー (Qiagen) 1.9 μL、および水 16.5 μL。 PCR プログラムは、重鎖およびカッパ軽鎖については、94 °C で 30 秒、57 °C で 30 秒、および 72 °C で 55 秒を 50 サイクル、続いて 72 °C で 10 分間でした。 PCR プログラムは、ラムダ軽鎖の場合、94 °C で 30 秒、60 °C で 30 秒、72 °C で 55 秒を 50 サイクル、その後 72 °C で 10 分間でした。 1 ラウンド目の PCR 後、最終反応液に 0.2 μL (0.5 U) HotStarTaq ポリメラーゼ、0.075 μL の 50 μM 3' リバースプライマー、 50 μM 5' フォワード プライマー 0.075 μL、25 mM dNTP 0.24 μL、10 × バッファー 1.9 μL、および水 16.5 μL。 PCR プログラムは PCR の最初のラウンドと同じでした。 4 μL の PCR 産物をアガロースゲル上で泳動し、約 500 bp の重鎖バンドまたは約 450 bp の軽鎖バンドの存在を確認しました。 重鎖または軽鎖アンプリコンの存在を示す PCR 反応液 5 μL を 2 μL の ExoSAP-IT (Thermo Fisher、カタログ番号 78201) と混合し、37 °C で 15 分間インキュベートし、続いて 80 °C で 15 分間インキュベートしました。余分なプライマーとヌクレオチドを加水分解します。 加水分解された 2 回目の PCR 産物は、2 回目の PCR で使用されたそれぞれのリバースプライマーを使用して Genewiz によって配列決定され、IMGT/V-Quest を使用して配列が分析されて、V、D、および J 遺伝子セグメントが特定されました。 ペアの重鎖 VDJ 配列と軽鎖 VJ 配列を、In-Fusion クローニング (Clontech、カタログ番号 638911) を使用して、ヒト IgG1、IgK、または IgL 定常領域を含む pTT3 由来の発現ベクターにクローニングしました 74。

分泌型 IgG は、1 mg/mL PEI Max を使用して、Freestyle 293 培地中で重鎖および軽鎖のペア発現プラスミドを 1:1 の比率で 106 細胞/mL の密度で同時トランスフェクトすることによって産生されました。 トランスフェクトされた細胞は、37 °C で穏やかに振盪しながら 7 日間培養されました。 培養物を2500×gで15分間遠心分離し、続いて0.2μMフィルターで濾過することによって上清を回収した。 次いで、清澄化した上清をプロテインＡアガロース（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２２８１２）とともにインキュベートし、その後、ＩｇＧ結合緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２１００７）で洗浄した。 抗体を、IgG 溶出バッファー (Thermo Scientific、カタログ番号 21004) を使用して、1 M トリス塩基 (pH 9.0) を含む中和バッファーに溶出しました。 精製した抗体を濃縮し、50 kDa 分子量カットオフの Amicon 限外濾過ユニットを使用して緩衝液を PBS に交換しました。

Fabは、10 mgのIgGを10 μgのLysC (New England Biolabs、カタログ番号P8109S)と37℃で一晩インキュベートし、続いてプロテインAと室温で1時間インキュベートすることによって生成しました。 次に、混合物を PVDF フィルターで遠心分離し、30 kDa Amicon Ultra サイズ排除カラムを使用して PBS 中で濃縮し、Superdex 200 (GE Healthcare Life Sciences、カタログ番号 17-5175-01) を使用してサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) によってさらに精製しました。 ) 5 mM HEPES および 150 mM NaCl 中で。

生物層干渉法 (BLI) アッセイは、Octet.Red 機器 (ForteBio) を使用し、室温で 500 rpm で振盪しながら実行されました。 見かけの親和性 (KD) 分析では、抗ペンタ His 捕捉センサー (ForteBio、カタログ番号 18–5120) を反応速度緩衝液 (0.01% ウシ血清アルブミン、0.02% Tween 20、および 0.005% NaN3 を含む PBS、pH 7.4) にロードしました。 0.5 μM の精製 RSV-A、RSV-B、HMPV、または HPIV3 preF を 150 秒間添加します。 ロード後、ベースラインシグナルをカイネティクスバッファーで 60 秒間記録しました。 次に、センサーを 266.7、133.3、66.7、33.3、または 16.7 nM の精製モノクローナル抗体を含むカイネティクス バッファーに 300 秒の結合ステップで浸漬し、続いて少なくとも 600 秒の解離フェーズでカイネティクス バッファーに浸漬しました。 最大応答は、各時点でネガティブコントロール mAb を使用して各検体含有ウェルからバックグラウンドシグナルを差し引いた後、結合ステップの最後の 5 秒間のナノメートルシフトを平均することによって決定されました。 カーブ フィッティングは、1:1 結合モデルと ForteBio Octet データ分析ソフトウェア リリース 9.0 を使用して実行されました。 競合結合アッセイでは、抗ペンタ His 捕捉センサーを 1 μM His タグ付き HPIV3 preF を含む反応速度バッファーに 300 秒間ロードしました。 ロード後、ベースラインシグナルをカイネティクスバッファーで 30 秒間記録しました。 次に、センサーを 40 μg/mL の第 1 抗体を含むカイネティクス バッファーに 300 秒間浸漬し、続いて 40 μg/mL の第 2 抗体を含むカイネティクス バッファーにさらに 300 秒間浸漬しました。 競合パーセントは、一次抗体の存在下での二次抗体のシグナルの最大増加を二次抗体単独の最大シグナルで割ることによって決定した。

Vero 細胞を 96 ウェル平底プレートに 2 つずつ播種し、48 時間培養し、MOI = 0.01 で HPIV3 とともに 37 °C で 1 時間インキュベートしました。 細胞を5回洗浄して、吸着されなかったウイルスを除去しました。 3 × 1 (10 μg/mL) または培地 (コントロール) を細胞に添加しました。 EVOS Cell Imaging System (Thermo Fisher) を使用して、感染後 1、3、および 5 日目に細胞間拡散および合胞体の形成を検査しました。

培養上清の中和スクリーニングのために、Vero 細胞を 96 ウェル平底プレートに播種し、48 時間培養しました。 13 日間の培養後、B 細胞培養上清 40 μL を、2000 プラーク形成単位 (pfu)/mL に希釈したスクロース精製 GFP-HPIV1 25 μL と 37 °C で 1 時間混合しました。 次に、Vero 細胞を 50 μL の上清/ウイルス混合物とともに 37 °C で 1 時間インキュベートして、ウイルスを吸着させました。 次に、各ウェルを、0.8% メチルセルロースおよび 1.2% の 0.05% トリプシンを含む 100 μL の DMEM で覆いました。 感染後 5 日目に、Typhoon イメージャーを使用して蛍光プラークをカウントしました。

モノクローナル抗体の中和力価は、60%プラーク減少中和試験(PRNT60)によって決定されました。 Vero細胞を24ウェルプレートに播種し、48時間培養しました。 モノクローナル抗体を 120 µL DMEM で 1:4 段階希釈し、2000 pfu/mL に希釈したスクロース精製 RSV、HMPV、HPIV3、または HPIV1 120 µL と 37 °C で 1 時間混合しました。 ベロ細胞を 100 μL の抗体/ウイルス混合物とともに 37 °C で 1 時間インキュベートして、ウイルスを吸着させました。 次いで、各ウェルを、0.8％メチルセルロースを含む500μLのDMEMで覆った。 感染後 5 日目に、Typhoon イメージャーを使用して蛍光プラークをカウントしました。 PRNT60力価は線形回帰分析(http://exon.niaid.nih.gov/plaquereduction/)により計算した。

1.47 mgのRSV preFと1.45 mgのMxR Fabを混合し、穏やかに揺り動かしながら4℃で一晩インキュベートした後、10/300 Superose 6カラム（Cytiva、カタログ番号29091596）でSEC精製しました。 非常に幅広いピークが溶出され、10 kDa カットオフの Amicon 限外濾過ユニット (Sigma-Aldrich、カタログ番号 UFC8030) を使用して 9 つの最大画分が 0.22 mg/mL に濃縮されました。 3 × 1 の場合、Superdex 200 16/600 SEC カラム (Cytiva、カタログ番号 28989335) で SEC 精製する前に、50 μg の HPIV3 preF を 150 μg の 3 × 1 Fab と 4 °C で穏やかに揺り動かしながら一晩インキュベートしました。 単一の狭い高分子量ピークが溶出され、10 kDa カットオフの Amicon 限外濾過ユニットを使用して 0.4 mg/mL まで濃縮されました。

両方の複合体を、Vitrobot Mkを使用してQuantifoil 1.2/1.3 UltrAu 300メッシュグリッド(Electron Microscopy Sciences、カタログ番号Q350AR13A)上で凍結させた。 IV (Thermo Fisher)、22 °C、湿度 100%。 凍結開始の 30 分前にドデシル-β-d-マルトシド (DDM) をサンプルに添加し (最終濃度 0.05%)、PELCO easiGlow™ (Tedpella、カタログ番号 91000) を使用してグリッドをグロー放電させました。 収集に使用した最終的な MxR:RSV グリッドは、0.21 mg/mL、ブロット時間 14 秒、ブロット力 0、および適用とブロッティングの間の待機 5 秒のサンプル 4 μL で凍結されました。 収集に使用した最後の 3 × 1:HPIV3 グリッドは、0.19 mg/mL、ブロット時間 12 秒、ブロット力 0、および適用とブロッティングの間の待機 15 秒のサンプル 4 μL で凍結されました。

データセットは、Pacific Northwest Center for Cryo-EM (PNCC) にある K3 DED (Gatan Inc.) を備えた 300 kV で動作する Titan Krios G3 クライオ電子顕微鏡 (Thermo Fisher Scientific) で収集されました。 データは、シリアル EM を使用して倍率 92,000 倍 (超解像度モードを使用すると 0.514425 Å/px) で 50 フレームのムービーで収集されました。 どちらのコレクションも 24 時間実行され、3 × 1:HPIV3 では 6282 個のムービー、MxR:RSV では 5796 個のムービーが生成されました。 3 × 1:HPIV3 は、スクリーニング中に観察された優先配向のため、30°の傾斜で収集されました。

データセットは、cryoSPARC v3.3.175 を使用して処理されました。 インポート、パッチ動き補正 (1.02885 Å/px にビニングされた顕微鏡写真)、およびコントラスト伝達関数 (CTF) の推定後、顕微鏡写真は 4 Å 未満の CTF フィットに合わせてキュレーションされました。 ブロブ ピッカーを使用して約 50,000 個の粒子を選択し、2D 分類を受けてテンプレート ベースのピッキング用のテンプレートを生成しました。 これらのピックは検査され、厳選され、MxR:RSV の場合は 149 万個の粒子、3 × 1:HPIV3 の場合は 202 万個の粒子を含む抽出 (2.0577 Å/px で 192 ピクセルのボックス サイズ) が行われました。

2 ラウンドの 2D 分類 (それぞれ 100 クラス) の後、結合した 3 つの Fab を示す 377,982 個の MxR:RSV 粒子が残りました。 単一の ab-initio モデルが生成され、改良されました。 粒子は 1.02885 Å/px で再抽出され、局所 CTF リファインメントと C3 対称性による不均一リファインメントが行われました。 この後、パーティクルはさらに厳選され、ローカル モーション補正を使用して再抽出され、354,958 個のパーティクルが生成されました。 CH1 領域と GCN4 ドメインを切り取るカスタム マスクによる不均一リファインメントにより、C1 対称性を使用した場合は 2.41 Å、C3 対称性を使用した場合は 2.24 Å の解像度の鮮明なマップ (GSFSC = 0.143) が生成されました。

3 × 1:HPIV3 のテンプレート生成では、1、2、または 3 つの Fab がバインドされたクラスの混合が生成され、そのすべてが元のテンプレートの選択に使用されました。 100 クラスで 2D 分類を 1 回実行し、任意の数の Fab が結合している孤立粒子を選択し、130 万粒子のスタックを生成しました。 Ab-initio モデリングにより、HPIV3 preF に結合した 1 つの Fab を含む単一マップが生成され、その後の改良により、C1 対称性を使用した 0.143 カットオフで GSFSC 分解能 3.7 Å のマップが生成されました。 追加の 3 つの Fab マップは、C3 対称性を 4.3 Å まで不均一に改良して作成されましたが、解像度が低いため、このマップはモデル構築には使用されませんでした。 C3 均質リファインメントを実行し、続いて C3 対称拡張、4 つのクラスによる 3D 分類、および最も相同なクラスからの重複粒子の削除を実行することで、若干の改善が行われ、104 万個の粒子のスタックが生成されました。 ローカル モーション補正ジョブを使用してパーティクルを再抽出し、1.02885 Å/px にビニングし、C1 不均一リファインメントを使用してマップをリファインしました。 これにより、解像度 3.62 Å (GSFSC = 0.143) の最終的な鮮明化されたマップが生成されました。

両方の最終マップは、DeepEMhancer77 モジュールを備えた COSMIC2 コンピューター 76 を使用してさらに処理されました。 MxR:RSV および 3 × 1:HPIV3 の構造をマップに当てはめる際には、DeepEM 強化マップと crioSPARC シャープ マップの両方が使用されました。 構造の改良と検証は、Phenix78 ソフトウェア スイートと Coot79 で行われました。 必要に応じて ISOLDE81 プラグインを使用して、ChimeraX80 でさらなる改良が行われました。 マスクされていないハーフ マップ、シャープ化されたマップ、および使用されたマスクは、PDB および EMDB に保存されました。 すべてのグラフィックは Pymol82 で作成されました。 グラフは、GraphPad Prism 9 を使用して作成されました。埋没表面積解析は、PDBePISA83 サーバーを使用して実行されました。

すべての手順はフレッド・ハッチ施設内動物管理使用委員会によって審査および承認され、施設および国立衛生研究所のガイドラインに従って実施されました。 ゴールデン シリアン ハムスター (Mesocricetus auratus) に、105 pfu の RSV、HMPV、HPIV3、または HPIV1 100 μL を鼻腔内感染させました。 サンプルサイズ（血清抗体濃度実験では全体 n = 24、単回感染実験では n = 96、同時感染実験では n = 24）は、コットンラットモデルにおける RSV モノクローナル抗体の有効性を試験する以前に発表された実験と一致していました 58。 59、84、85。 RSV、HMPV、HPIV3、または HPIV に感染した成人では性別と臨床転帰との関連が観察されていないため、この研究では雄動物 (4 ～ 8 週齢) のみが評価されました 186,87。 感染の2日前に、モノクローナル抗体を50μL PBS中5、2.5、または1.25 mg/kgで筋肉内投与した。 同時感染モデルでは、105 pfu の各ウイルスを 100 μL 1 × DPBS に混合し、5 mg/kg の各モノクローナル抗体を 50 μL 1 × DPBS に混合しました。 感染５日後にプラークアッセイによるウイルス力価測定のために鼻甲介および肺を取り出し、ＤＭＥＭ中での遠心分離によって清澄化した。 コンフルエントなベロ細胞単層を、２４ウェルプレート中で希釈したホモジネートを用いて二重に接種した。 37℃で1時間インキュベートした後、ウェルを0.8％メチルセルロース（HMPVおよびHPIV1で攻撃した動物からの標本用に1.2％の0.05％トリプシンで作製）で覆った。 5日後、タイフーンイメージャーを使用してプラークを計数し、組織1グラムあたりのpfuとして力価を決定した。 リアルタイム PCR によるウイルス量の定量化のために、鼻甲介および肺サンプルのアリコートも保存しました。

MxR および 3×1 の血清濃度を ELISA によって測定しました。 簡単に説明すると、Nunc maxsorp 96 ウェル プレート (Thermo Fisher、カタログ番号 442404) を 100 ng のヤギ抗ヒト Fab (Jackson ImmunoResearch、カタログ番号 109-005-097) で 4 °C で 90 分間コーティングしました。 ウェルを１×ＤＰＢＳで３回洗浄し、次いで１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ２１５３）を含有する１×ＤＰＢＳとともに室温で１時間インキュベートした。 抗原でコーティングされたプレートを血清とともに 4 °C で 90 分間インキュベートしました。 標準曲線は、パリビズマブの段階 2 倍希釈を使用して作成されました。 ウェルを１×ＤＰＢＳで３回洗浄し、続いて１：６０００の希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒト全Ｉｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３１４１２）とともに１時間インキュベートした。 次にウェルを 1×DPBS で 4 回洗浄し、続いて TMB 基質 (SeraCare、カタログ番号 5120-0053) と 5 ～ 15 分間インキュベートしました。 吸光度は、Softmax Pro プレートリーダー (Molecular Devices) を使用して 405 nm で測定しました。 各サンプル中の抗体の濃度は、標準曲線と希釈率を参照して決定されました。

QIAamp vRNA ミニキット (Qiagen、カタログ番号 52904) を使用して、140 μL のサンプルホモジネートからウイルス RNA を抽出しました。 RNA を 50 μL の水で溶出し、11 μL の溶出液を逆転写に使用しました。 RSV (5'-TCCAGCAAATACACCATCCAAC-3') および HPIV3 (5'-CTAGAAGGTCAAGAAAAGGGAACTC-3') 用のカスタム逆転写プライマーは、それぞれ RSV および HPIV3 のゲノムに特異的に結合するように設計されました。 2 μM の各プライマー 1 μL を、1 μL の RNaseOut、1 μL の 0.1 M DTT、4 μL の SuperScript IV バッファー、および 1 μL の SuperScript IV 逆転写酵素を含む RT 反応混合物に含めました (Thermo Fisher、カタログ番号 18090200) ）。 逆転写は、42 °C で 10 分間、20 °C で 10 分間、50 °C で 10 分間、80 °C で 10 分間のサイクルで実行されました。 カスタム TaqMan 遺伝子発現アッセイは、RSV (フォワード プライマー 5'-TGACTCTCCTGATTGTGGGATGATA-3'、リバース プライマー 5'-CGGCTGTAAGACCAGATCTGT-3'、およびレポーター 5'-CCCCTGCTGCTAATTT-3') および HPIV3 (フォワード プライマー、5'-CGGTGACACAGTGGATCAGATT) 用に開発されました。 -3'、リバースプライマー 5'-TGTTTCAACCATAAGAGTTACCAAGCT-3'、およびレポーター 5'-ACCGCATGATTGACCC-3'）。 PCR 反応は、これらのプライマー 2.5 μL、逆転写反応 10 μL、UNG を含む TaqMan Universal Master Mix II 25 μL (Thermo Fisher、カタログ番号 4440038)、および水 12.5 μL から構成されていました。 リアルタイム PCR は、QuantStudio 7 Flex リアルタイム PCR システムを使用し、次のパラメータで実行しました: 50 °C で 2 分間、95 °C で 10 分間、その後 95 °C で 15 秒、60 °C で 40 サイクル1分。 標準曲線を作成するために、pfu/mL 単位で既知の力価を持つウイルス RNA を、RSV のスクロース精製ウイルスストックから抽出しました。 逆転写を上記のように行った。 逆転写反応物を水で 1:4 に 8 倍に連続希釈しました。 リアルタイム PCR を上記のように実行し、QuantStudio リアルタイム PCR ソフトウェア v1.0 を使用してウイルス量を pfu/g に補間する標準曲線を作成しました。

統計分析は、GraphPad Prism 7 を使用して実行されました。ペアワイズ統計比較は、Mann-Whitney 両側検定を使用して実行されました。 p < 0.05 は統計的に有意であるとみなされました。 個々のサンプルのデータ ポイントが表示されます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の結果を裏付ける配列データと構造データは、タンパク質データ バンク (PDB) および電子顕微鏡データ バンク (EMDB) に寄託されており、3×1/HPIV3 および PDB のアクセッション番号 PDB 8DG8 (EMDB 27418) を通じてアクセスできます。 MxR/RSV 用の 8DG9 (EMDB 27419)。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

ジロー・ガティノー、A. et al. フランス南東部における2019年12月から2020年3月までの呼吸器ウイルス感染症に関連した死亡率と前年の死亡率の比較。 内部。 J.感染する。 ディス。 96、154–156 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ruckwardt, TJ、Morabito, KM & Graham, BS 呼吸器合胞体ウイルスワクチン開発からの免疫学的教訓。 イミュニティ 51、429–442 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ドライズデール、SB et al. さまざまな対象集団におけるRSウイルスワクチン開発の優先順位。 科学。 翻訳。 医学。 12、eaax2466 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kennedy, LB、Li, Z.、Savani, BN、および Ljungman, P. 同種異系造血細胞移植の成人レシピエントにおける一般的に使用されるワクチン接種に対する免疫応答の測定。 バイオル。 血液骨髄移植。 23、1614–1621 (2017)。

記事 Google Scholar

アンバティ、A.ら。 造血SCTにおける移植前インフルエンザワクチン接種の評価：ランダム化前向き研究。 骨髄移植。 50、858–864 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

ハリス、A.E. et al. 同種幹細胞移植のドナーとレシピエントにおける移植前ワクチン接種: 免疫防御の機会が失われがち? 骨髄移植。 50、899–903 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

Boeckh, M. 造血細胞移植レシピエントにおける呼吸器ウイルス感染症の課題。 Br. Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ． 143、455–467 (2008)。

PubMed PubMed Central Google Scholar

エラール、V.ら。 骨髄破壊的同種造血細胞移植後の気流低下：市中呼吸器ウイルスの役割。 J.感染する。 ディス。 193、1619–1625 (2006)。

論文 PubMed Google Scholar

Agha, R. & Avner, JR 新型コロナウイルス感染症のパンデミック中に観察された季節性 RSV 急増の遅れ。 小児科 148、e2021052089 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

フォーリー、DA et al. 2019年のコロナウイルス感染症関連の公衆衛生対策の縮小に伴い、オーストラリアの子供におけるRSウイルスが季節の変わり目に再流行している。 クリン。 感染する。 ディス。 73、e2829–e2830 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジーリング、WD 他。 ニューヨーク市における成人の入院に伴う呼吸器ウイルスの発生率と負担の比較。 インフルエンザその他の呼吸器。 ウイルス 15、670–677 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リー、N.ら。 入院した成人における非インフルエンザ呼吸器ウイルス感染症の負担：カナダの 2 つのセンターからの複数年にわたる監視コホートの分析。 CMAJ 193、E439–E446 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ベイカー、RE 他。 新型コロナウイルス感染症の将来の風土病の動向に対する非医薬品介入の影響。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 117、30547–30553 (2020)。

論文 CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Corti, D. et al. ヒトモノクローナル抗体による 4 つのパラミクソウイルスの交差中和。 Nature 501、439–443 (2013)。

記事 CAS ADS PubMed Google Scholar

シファー、JT et al. 骨髄破壊的造血幹細胞移植と非骨髄破壊的造血幹細胞移植後の市中呼吸器ウイルス感染症のタイミングと重症度。 ヘマトロジカ 94、1101–1108 (2009)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

クロッティ、MP 他成人におけるウイルス性肺炎の疫学、同時感染、転帰：観察コホート研究。 医学 94、e2332 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Saez-Llorens, X. et al. RSウイルス感染症で入院した小児におけるパリビズマブ療法の安全性と薬物動態。 小児科。 感染する。 ディス。 J. 23, 707–712 (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

マイスナーHC 小児におけるウイルス性細気管支炎。 Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 374、62–72 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Polack, FP、Stein, RT & Custovic, A. この症候群を細気管支炎と呼ぶことに私たちは同意しました。 J.感染する。 ディス。 220、184–186 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

White, JM、Delos, SE、Brecher, M. & Schornberg, K. ウイルス膜融合タンパク質の構造と機構: 共通のテーマに関する複数のバリエーション。 クリティカル。 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． モル。 バイオル。 43、189–219 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Connolly, SA、Leser, GP、ying, HS、Jardetzky, TS & Lamb, RA リポソーム結合と電子顕微鏡によって観察された融合前構造から融合後構造へのパラミクソウイルス F タンパク質のリフォールディング。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 103、17903–17908 (2006)。

論文 CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ngwuta、JO 他融合前 F 特異的抗体は、ヒト血清中の RSV 中和活性の大きさを決定します。 科学。 翻訳。 医学。 7、309ra162 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ギルマン、MS 他。 自然感染した成人ドナーのメモリーB細胞からのRSV抗体レパートリーの迅速なプロファイリング。 科学。 イムノール。 1、eaaj1879 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ying、HS、Paterson、RG、Wen、X.、Lamb、RA & Jardetzky、TS パラミクソウイルス (hPIV3) 融合タンパク質の未切断外部ドメインの構造。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 102、9288–9293 (2005)。

論文 CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moscona, A. ヒトパラインフルエンザウイルス 3 型と宿主細胞表面との相互作用。 小児科。 感染する。 ディス。 J. 16, 917–924 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

スチュワート・ジョーンズ、GBE 他ヒトパラインフルエンザウイルス 1 ～ 4 型に対する 4 価融合糖タンパク質ワクチンの構造に基づく設計。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 115、12265–12270 (2018)。

論文 CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boonyaratanakornkit、J. et al. ヒトパラインフルエンザウイルス 3 型感染に対する防御抗体。 MAbs 13、1912884 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

バトルズ、MB 他融合前安定化ヒトメタニューモウイルス F 糖タンパク質の構造と免疫原性。 ナット。 共通。 1528 年 8 月 (2017 年)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

マス、V.ら。 融合後立体構造におけるヒトメタニューモウイルス F タンパク質の工学、構造、および免疫原性。 PLoS 病巣。 12、e1005859 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ヘンリクソン、KJ パラインフルエンザウイルス。 クリン。 Microbiol Rev. 16、242–264 (2003)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

グラハム、BS 呼吸器合胞体ウイルスのワクチン開発。 カー。 意見。 ヴィロル。 23、107–112 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

グリフィン、MP 他。 早産児の RSV 予防のための単回投与ニルセビマブ。 Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 383、415–425 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ハミット、LL他。 健康な後期早産児および正期産児の RSV 予防のためのニルセビマブ。 Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 386、837–846 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウェン、Ｘら。 RSウイルスとヒトメタニューモウイルスの抗体交差中和の構造基盤。 ナット。 微生物。 2、16272 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

タン、A.ら。 強力な広範な中和ヒト RSV 抗体は、融合糖タンパク質の保存部位 IV を標的とします。 ナット。 共通。 10、4153 (2019)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

ギルマン、MSAら。 三量体融合前 RSV F タンパク質の一過性の開口。 ナット。 共通。 2105 年 10 月 (2019 年)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

ムーサ、JJ 他ニューモウイルス融合タンパク質上の抗原部位 IV のヒト抗体認識。 PLoS 病巣。 14、e1006837 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Harshbarger、W. et al. 呼吸器合胞体ウイルス中和抗体の収束した構造的特徴と融合前F. PLoS PathogのサイトVエピトープの可塑性。 16、e1008943 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

グッドウィン、E.ら。 RS ウイルスに感染した乳児は、体細胞超変異を持たない強力な中和抗体を生成します。 イミュニティ 48、339–349 e335 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

オットリーニ、MG 他。 ヒトパラインフルエンザウイルス 3 型感染のコットンラットモデルにおける免疫応答の半許容的複製と機能的側面。 J. ヴィロル将軍。 77、1739–1743 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

MS、Boukhvalova、ジョージア州プリンス、JC ブランコ 呼吸器ウイルス感染症のコットンラットモデル。 Biologicals 37、152–159 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y.、Niewiesk, S. & Li, J. ヒトメタニューモウイルスの小動物モデル: コットンラットはハムスターやマウスよりも寛容です。 病原体 3、633–655 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

PR ワイド、SN チェッティ、AM ジュエル、SL スクーンオーバー、PA ピドラ 潜在的な hMPV 抗ウイルス薬およびワクチンを同定および評価するためのワタラット - ヒトメタニューモウイルス (hMPV) モデルの開発。 アンチビル。 解像度 66、57–66 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

スキアドプロス、MH 他。 最大 3 つの外来糖タンパク質を発現する組換えヒト パラインフルエンザ ウイルス 3 型ベクターの複製および免疫原性の評価。 ウイルス学 297、136–152 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ニューマン、JT 他。 異種パラミクソウイルスからの温度感受性および弱毒化変異の導入による、組換えヒトパラインフルエンザウイルス 1 型ワクチン候補の生成。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 78、2017–2028 (2004)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu、X.ら。 ビリオンパッケージング用に修飾された呼吸器合胞体ウイルス融合前Fタンパク質を発現するヒトパラインフルエンザウイルス3型は、防御的な鼻腔内ワクチン候補を生成する。 PLoS ONE 15、e0228572 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Herfst, S. et al. ハムスターに防御免疫を提供する温度感受性ヒトメタニューモウイルス株の生成。 J. ヴィロル将軍。 89、1553–1562 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wen, SC & Williams, JV ヒトメタニューモウイルスに対する予防接種と治療のための新しいアプローチ。 クリン。 ワクチン。 イムノール。 22、858–866 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

バートレット、EJ et al. ヒトパラインフルエンザウイルス 1 型 C タンパク質は、宿主のインターフェロンおよびアポトーシス反応を阻害する非必須タンパク質であり、非ヒト霊長類における効率的な複製に必要です。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 82、8965–8977 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Herfst, S. et al. ヒトメタニューモウイルスのFサブユニットワクチンによるシリアンゴールデンハムスターの免疫化は、同種または異種株による攻撃に対する防御を誘導します。 J. ヴィロル将軍。 88、2702–2709 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Schickli、JH et al. ヒトメタニューモウイルス M2-2 を欠失させると、ハムスターの突然変異頻度が増加し、成長が減弱します。 ヴィロル。 J. 5、69 (2008)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

スキアドプロス、MH 他。 2 つの主要なヒトメタニューモウイルス遺伝子系統は抗原的に非常に関連しており、融合 (F) タンパク質がこの抗原関連性に大きく寄与しています。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 78、6927–6937 (2004)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Crowe、JE Jr. 他弱毒化され、遺伝的に安定しており、齧歯類および非ヒト霊長類に対して免疫原性を示す、サブグループ B の RS ウイルスの生ワクチンです。 J.感染する。 ディス。 173、829–839 (1996)。

論文 PubMed Google Scholar

Taylor, G. RS ウイルス感染の動物モデル。 ワクチン 35、469–480 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ブッフホルツ、UJら。 ヒトメタニューモウイルスの M2 遺伝子オープンリーディングフレーム 1 および 2 の欠失: RNA 合成、弱毒化、および免疫原性への影響。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 79、6588–6597 (2005)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マクファイル、M.ら。 ヒトメタニューモウイルス (hMPV) のワクチン候補を評価するための小動物および霊長類モデルの同定と、hMPV ワクチン設計への影響。 J. ヴィロル将軍。 85、1655–1663 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

BR マーフィーおよびPL コリンズ RS ウイルスおよびパラインフルエンザウイルス用の生弱毒化ウイルスワクチン: 逆遺伝学の応用。 Ｊ．クリン． 調査します。 110、21–27 (2002)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boukhvalova, MS、Yim, KC & Blanco, J. RS ウイルスに対するワクチンと抗ウイルス薬をテストするためのコットン ラット モデル。 アンチビル。 化学。 化学母。 26、2040206618770518 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boukhvalova, M.、Blanco, JC、Falsey, AR & Mond, J. 新規 RSV Ig RI-002 による治療は、免疫不全状態の Sigmodon hispidus におけるウイルス複製を制御し、肺損傷を軽減します。 骨髄移植。 51、119–126 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

ジョンソン、S.ら。 RS ウイルスに対して強力な in vitro および in vivo 活性を持つヒト化モノクローナル抗体 (MEDI-493) の開発。 J.感染する。 ディス。 176、1215–1224 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Martin, ET、Kuypers, J.、Wald, A. & Englund, JA 複数ウイルスと単一ウイルスの呼吸器感染症: 入院中の小児におけるウイルス量と臨床疾患の重症度。 インフルエンザその他の呼吸器。 ウイルス 6、71–77 (2012)。

論文 PubMed Google Scholar

Whaley, RE et al. 初代ヒトB細胞およびモノクローナル中和抗体のハイスループット単離をサポートするための、費用対効果の高い細胞株の生成。 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 方法 488、112901 (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

マクレラン、JS 呼吸器合胞体ウイルス融合糖タンパク質上のエピトープの中和。 カー。 意見。 ヴィロル。 11、70–75 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thomas、NJ、Hollenbeak、CS、Ceneviva、GD、Geskey、JM & Young、MJ 小児骨髄移植後の RS ウイルスによる死亡を防ぐためのパリビズマブ予防: 意思決定分析モデル。 J. Pediatr. ヘマトール。 オンコル。 29、227–232 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジョイス、MG 他。 呼吸器合胞体ウイルスサブタイプ B 由来の DS-Cav1 安定化融合糖タンパク質の結晶構造と免疫原性。Pathog。 免疫。 4、294–323 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

レビン、MJ 他 Covid-19の予防のための筋肉内AZD7442（チキサゲビマブ-シルガビマブ）。 N 英語 J 医学 386、2188–2200 (2022)。

Biacchesi, S. et al. cDNA からのヒトメタニューモウイルスの回収: in vitro での増殖の最適化と追加遺伝子の発現。 ウイルス学 321、247–259 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

バートレット、EJ et al. 逆遺伝学によって設計されたヒトパラインフルエンザウイルス I 型 (HPIV1) ワクチン候補は、アフリカミドリザルでは弱毒化され、有効です。 ワクチン 23、4631–4646 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ムニル、S.ら。 RS ウイルスの非構造タンパク質 1 および 2 はヒト樹状細胞の成熟を抑制します。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 82、8780–8796 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マクレラン、JS 他 RSウイルスに対する融合糖タンパク質ワクチンの構造に基づく設計。 サイエンス 342、592–598 (2013)。

論文 CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウェン、Ｘら。 中和抗体とのヒトメタニューモウイルス融合タンパク質の構造により、ニューモウイルスの抗原部位が特定されます。 ナット。 構造体。 モル。 バイオル。 19、461–463 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウー、Ｘら。 エンベロープの合理的な設計により、HIV-1 に対する広範な中和ヒトモノクローナル抗体が同定されます。 サイエンス 329、856–861 (2010)。

論文 CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang、J.ら。 末梢血 B 細胞からのヒトモノクローナル抗体の分離。 ナット。 プロトック。 8、1907 ～ 1915 年 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マクガイア、AT 他。 特別に修飾された Env 免疫原は、トランスジェニック マウスにおいて広範に中和する HIV-1 抗体の B 細胞前駆体を活性化します。 ナット。 共通。 7、10618 (2016)。

論文 CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Punjani, A.、Rubinstein, JL、Fleet, DJ & Brubaker, MA crioSPARC: 教師なしの迅速なクライオ EM 構造決定のためのアルゴリズム。 ナット。 方法 14、290–296 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Cianfrocco, MA、Wong-Barnum, M.、Youn, C.、Wagner, R. & Leschziner, A. COSMIC2: クライオ電子顕微鏡による構造決定のためのサイエンス ゲートウェイ。 持続可能性、成功、影響に関する先端研究コンピューティングの実践と経験 2017 の議事録 (David, H. 編) Vol. 5、(Association for Computing Machinery、米国ニューヨーク州ニューヨーク、2017)。

Sanchez-Garcia、R. et al. DeepEMhancer: クライオ EM ボリュームの後処理のための深層学習ソリューション。 共通。 バイオル。 4, 874 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Liebschner、D. et al. X 線、中性子、電子を使用した高分子構造の決定: Phenix における最近の開発。 アクタクリスタログル。 宗派。 D 構造体。 バイオル。 75、861–877 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

Emsley, P.、Lohkamp, B.、Scott, WG & Cowtan, K. オオバンの特徴と開発。 アクタクリスタログル。 宗派。 Dバイオル。 クリスタロガー。 66、486–501 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

ペッターセン、EF 他。 UCSF ChimeraX: 研究者、教育者、開発者向けの構造視覚化。 タンパク質科学。 30、70–82 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Croll、TI ISOLDE: 低解像度の電子密度マップにモデルを構築するための物理的に現実的な環境。 アクタクリスタログル。 宗派。 D 構造体。 バイオル。 74、519–530 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

Schrodinger, LLC PyMOL 分子グラフィックス システム バージョン 2.1.1 (Schrodinger, LLC、2015) https://pymol.org/2/support.html?#citing。

Krissinel, E. & Henrick, K. 結晶状態からの高分子集合体の推論。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 372、774–797 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Johnson, RA、Prince, GA、Suffin, SC、Horswood, RL & Chanock, RM シクロホスファミド処理コットンラットにおける呼吸器合胞体ウイルス感染症。 感染する。 免疫。 37、369–373 (1982)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウー、Ｈら。 上気道および下気道におけるRSウイルス感染を予防するための超強力な抗体であるモタビズマブの開発。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 368、652–665 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhang、Y.ら。 中国の入院成人におけるRSウイルス感染症とA型インフルエンザ感染症の重症度と死亡率。 インフルエンザその他の呼吸器。 ウイルス 14、483–490 (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

リー、N.ら。 RSウイルス感染症で入院した成人の罹患率と死亡率は高い。 クリン。 感染する。 ディス。 57、1069–1077 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

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シアトル エリア コントロール コホートの PBMC については、Julie McElrath に感謝します。 研究室のスペースと設備の使用に対する Leo Stamatatos。 CD40L/IL2/IL21 発現 3T3 細胞を提供してくれた Andrew McGuire。 Ramasamy Bakthavatsalam と LifeCenter Northwest は、匿名化された脾臓の残骸を提供してくれました。 Ursula Buchholz、Shirin Munir、および Peter Collins は、GFP 発現 RSV、HMPV、HPIV3、および HPIV1 を提供してくれました。 HPIV3 preF の発現については Peter Kwong、Guillaume Stewart-Jones、および Aliaksandr Druz。 RSV preF の発現については Barney Graham。 HMPV preF の発現については Theodore Jardetzky と Xiaolin Wen。 原稿の校正には Steve Voght が協力してくれました。 Paula Culver、Francesca Urselli、Laura Yates には管理サポートを提供していただきました。 機器に関するサポートについては、Fred Hutchinson フローサイトメトリー共有リソースを参照してください。 ハムスターの飼育に関する支援のためのフレッド・ハッチンソン比較医学共有リソース。 Taylor Lab と Boonyaratanakornkit Lab のメンバーには有益な議論をしていただきました。 実験的な回路図は BioRender.com で作成されました。 この研究は、ワクチン・感染症部門ファカルティ・イニシアチブ（JBおよびJJT）およびフレッド・ハッチンソンがんセンターからのエバーグリーン・ビヨンド・パイロット賞（JBおよびJJT）、IgMバイオサイエンス（JBおよびJJT）とのスポンサー研究契約によって支援されました。米国移植細胞療法学会（JB）からは研究者賞、全米骨髄ドナープログラム（JB）からはエイミー・ストレルツァー・マナセビット賞を受賞。 この研究の一部は、NIH の U24 GM129547 の支援を受け、OHSU の PNCC で実施され、生物環境研究局が後援する DOE 科学局のユーザー施設である EMSL (grid.436923.9) を通じてアクセスされました。 さらに電子顕微鏡データは、P30 CA015704 によって部分的にサポートされている Fred Hutchinson Cancer Center Electron Microscopy Shared Resource を使用して生成されました。 内容は著者のみの責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

これらの著者は同様に貢献しました: Madelyn Cabán、Justas V. Rodarte、Madeleine Bibby。

ワクチンおよび感染症部門、フレッド・ハッチンソンがんセンター、米国ワシントン州シアトル

マデリン・カバン、ジャスタス・V・ロダルテ、マデリーン・ビビー、マシュー・D・グレイ、ジャスティン・J・テイラー、マリー・パンセラ、ジム・ブーニャラタナコーンキット

米国ワシントン州シアトルのワシントン大学免疫学部および国際保健学部

マデリン・キャバン & ジャスティン・J・テイラー

ワシントン大学医学部、シアトル、ワシントン州、米国

ジム・ブーニャラタナコーンキット

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MC と MB は実験を設計、実施し、データを分析し、原稿を執筆しました。 MDG は実験を実施し、データを分析し、原稿を編集しました。 JVR と MP は調整して構造解析を実行し、原稿を執筆しました。 JJT は研究を考案し、実験を計画し、データを分析し、原稿を編集しました。 JB は研究を発案し、実験を計画して実施し、データを分析し、原稿を書きました。

Justin J. Taylor、Marie Pancera、Jim Boonyaratanakornkit との通信。

著者の JB と JJT は、フレッド ハッチンソンがんセンターによって提出された 3×1 抗体と MxR 抗体に関する特許出願の発明者です。 残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Yaroslav Tsybovsky と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

カバン、M.、ロダルテ、JV、ビビー、M. 他一般的な風土病の呼吸器ウイルスに対する交差防御抗体。 Nat Commun 14、798 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-36459-3

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受信日: 2022 年 6 月 27 日

受理日: 2023 年 2 月 1 日

公開日: 2023 年 2 月 13 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36459-3

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