2 つの匂い受容体が 1 を調節する | 北京アジャイルリフトベンチャーズグループ株式会社

Communications Biology volume 6、記事番号: 176 (2023) この記事を引用

1578 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

東洋ショウジョウバエ Bactrocera dorsalis (Hendel) は、果樹作物の悪名高い害虫です。妊娠中の雌は、宿主植物の揮発性物質を検出することによって、適切な産卵場所を見つけます。今回我々は、マンゴー由来の揮発性物質である1-オクテン-3-オールがメスのハエの産卵行動を制御していることを実証する。 2 つの匂い受容体 (BdorOR7a-6 および BdorOR13a) が、qPCR 分析、アフリカツメガエル卵母細胞および HEK 293 細胞における異種発現、その後の in vitro 結合アッセイ、および CRISPR/ B. dorsalis における Cas9 ゲノム編集。分子ドッキングと部位特異的突然変異誘発を使用して、1-オクテン-3-オールの主要な結合部位を決定します。我々の結果は、1-オクテン-3-オールが妊娠中の雌を誘引する可能性と、B. dorsalis におけるその認識の分子機構を実証している。したがって、BdorOR7a-6 および BdorOR13a は、雌性誘引物質の開発のための分子標的として使用できます。さらに、我々の部位特異的突然変異誘発データは、より効率的な誘引物質を生成するための 1-オクテン-3-オールの化学工学を促進します。

草食昆虫による適切な産卵場所の選択は、通常、好ましい宿主植物によって放出される揮発性物質を検出する妊娠中の雌の能力を反映する。例としては、果物の発酵によって放出されるテルペンを検出するショウジョウバエ Drosophila melanogaster 1,2、種子の発芽によって放出される 1-オクテン-3-オールと 3-オクタノンを検出するマメバエ Delia platura 3、カイコガのBombyx mori、桑の葉から放出される揮発性物質を検出し4、宿主の植物や昆虫から放出されるβ-カリオフィレン、α-ファルネセン、シス-3-ヘキセンオールを検出する寄生バチAnastatus japonicasを検出します5。果樹の最も破壊的で侵略的な害虫の 1 つである東洋ミバエ Bactrocera dorsalis (Hendel) は、完熟したマンゴー果実に卵を産むことを好みます 7、8、9、10。これは、妊娠中のメスが揮発性動物に惹かれることを反映していると考えられています。マンゴー果実からの揮発性物質である化学物質 1-オクテン-3-オールは、このハエの産卵場所選択のためのオリエンテーリングの手がかりの 1 つと考えられています 11,12。

昆虫の嗅覚系は、産卵行動を導く揮発性物質の使用において重要な役割を果たしています13、14、15。特定の揮発性物質の知覚に関与する臭気物質受容体（OR）は、特異的結合部位を同定するための戦略として直接結合アッセイと部位特異的突然変異誘発を使用し、曝露ベースの行動試験と機能喪失型突然変異を組み合わせて使用して決定できます16。。揮発性物質とその受容体を特徴づけると、逆化学生態学を使用して、主要な OR をより効率的に標的とする新規誘引物質を開発できます 13,17,18,19。たとえば、DmelOR19a は、D. melanogaster2 の産卵行動を制御する柑橘類のテルペンの認識に関与していることが判明しました。同様に、HassOR31 は、宿主植物によって放出される酪酸 Z-3-ヘキセニルに応答して Helicoverpa assulta の産卵行動をガイドすることが判明しました 13。さらに、CRISPR/Cas9 システムを使用して嗅覚受容体共発現受容体 (BdorOrco) 遺伝子を欠失させると、メスの B. Dorsalis における 1-オクテン-3-オール誘発の産卵選好性が消失することを発見しました20。以前の研究では、BdorOR13a が in vitro で 1-オクテン-3-オールに結合することも直接示されています 16 が、これまでのところ in vivo の行動データは提示されていません。 B. dorsalis における 1-オクテン-3-オールの認識のさらなる解析は、高品質のゲノム配列の欠如による不完全な OR データセットによって妨げられています。

これらの課題に対処するために、私たちは新しい高品質のゲノムアセンブリを使用して、B. dorsalis OR ファミリーに包括的にアノテーションを付けました。我々は、処女雌と交配雌における OR の発現解析を用いて、1-オクテン-3-オールへの応答に関与している可能性がある 2 つの OR を同定し、異種発現系による候補 OR の試験とそれに続く電圧クランプ記録およびカルシウムイメージングアッセイを行った。さらに、これら 2 つの遺伝子は CRISPR/Cas9 システムを使用してノックアウトされました。結合部位分析と部位特異的突然変異誘発を使用して、結合機構を決定しました。また、妊娠女性と処女女性に対する 1-オクテン-3-オールの効果も比較しました。我々の結果は、B. dorsalis における 1-オクテン-3-オール知覚の分子機構を示し、1-オクテン-3-オールの化学工学に基づいたより効率的な雌誘引物質の開発のための分子標的を提供する。

私たちは、トラップルアーを使用して、完全に熟したマンゴーの果肉と1-オクテン-3-オールが処女および交尾した雌のB. dorsalisを誘引する能力を比較しました。完熟マンゴー果肉 (図 1a) と 10% (v/v) 1-オクテン-3-オール (鉱物油 (MO) で希釈) (図 1b) はどちらも、15 日間のマンゴーにとって非常に魅力的でした。交尾後雌の方が、生後15日の未熟な雌や生後3日の未熟な雌よりも高かったが、未熟な雌と未熟な雌の間には有意差はなかった。さらに、熟したマンゴーと 1-オクテン-3-オールの両方に対する妊娠雌の選好指数（臭気物質トラップ内のハエの数から MO トラップ内のハエの数を差し引き、導入されたハエの総数で割ったもの）は時間の経過とともに高くなりました。ほぼすべてのメスは約 8 時間後に選択を行い、その後は比較的安定した状態を維持しました。

a 生後 3 日の未熟雌、生後 15 日の未成熟雌、および生後 15 日の交尾雌のマンゴー果肉の選好指数。 b 生後 3 日の未熟雌、生後 15 日の処女雌、および生後 15 日の交尾雌に対する 1-オクテン-3-オールの選好指数。 c 産卵行動アッセイのための実験セットアップの概略図。 d–g マンゴーおよび/または1-オクテン-3-オールによって誘発される産卵行動。ヒートマップは、EnthoVision XT ソフトウェアを使用して監視された飛行跡に基づいています。配色は足跡の密度と 8 人の女性が費やした時間を表しており、赤が最も密度が高いことを示しています。画像は、24 時間後の産卵の程度を示しています。ヒストグラムは、各メスが産む卵の平均数を示します。データは、n ≥ 7 の生物学的複製の平均値 ± SE です。統計的有意性は、スチューデントの t 検定を使用して決定されました (***p < 0.001)。 d マンゴー果肉 vs MO。 e 1-オクテン-3-オール vs MO。 f マンゴー果肉 vs 1-オクテン-3-オール。 g マンゴー果肉 + 1-オクテン-3-オール vs マンゴー果肉 + MO。

図1cに示す実験的アプローチを使用して、熟したマンゴーと1-オクテン-3-オールが産卵行動に及ぼす影響を研究しました。簡単に説明すると、約 60 mg のマンゴー果肉または 20 μL の 1-オクテン-3-オール溶液をペトリ皿の片側 (ポイント L) に置き、反対側 (ポイント R) に 20 μL の MO を置き、その後、ハエ。マンゴーの果肉を点 L に、MO を点 R に置いた場合、各メスが産んだ卵の平均数は、点 L では 27 ± 8 (n = 7)、点 R ではほぼゼロでした (p < 0.001、スチューデントの t 検定)。、ハエの足跡は主にマンゴーの果肉の周りに集中していました（図1d）。 1-オクテン-3-オールを点Lに適用し、MOを点Rに適用した場合にも同様の結果が観察されました（図1e）。マンゴーの果肉を1-オクテン-3-オールに対して直接テストしたところ、ハエは1-オクテン-3-オール領域に有意に多くの卵を産みました（図1f）。さらに、妊娠中の雌は、MOを添加したマンゴー果肉と比較して、1-オクテン-3-オールを添加したマンゴー果肉を好むことを示し、マンゴー果肉または1-オクテン-3-オール単独と比較して卵の数が多かった（図1）。 1g）。すべての実験において、ハエの足跡は好ましい産卵場所の周囲に集中していました。これらの結果は、1-オクテン-3-オールがB. dorsalisの雌を制御するためのルアーとして適している可能性があることを示した。産卵行動は補足ムービー 1 ～ 4 でさらに詳しく示されています。

BLASTXを使用して、既知のキイロショウジョウバエORのアミノ酸配列およびPfamドメインに対してB. dorsalisゲノムコンティグを30％の同一性カットオフでスクリーニングすることにより、74個のB. dorsalis OR遺伝子を同定しました（補足表1、補足データ1）。。コンティグは、CNGBdb (アクセッション番号 CNP0003192) に提出された高品質の最終的な B. dorsalis ゲノムアセンブリに由来しています。また、アンテナ (GenBank SRR9026238)、上顎触骨および吻 (アクセッション番号 CNP0003333)、およびその他の組織 (アクセッション番号 CNP0003334) を含む、いくつかの B. 背部組織トランスクリプトームも含めました。 BLASTN検索を使用してORの全長コード配列を予測し、RT-PCRによってそれらの配列を決定しました。 D. melanogaster ORのアミノ酸配列に基づく相同性検索により、BdorOR7a、BdorOR33b、BdorOR59a、BdorOR63a、BdorOR67d、BdorOR94aを含むいくつかのORの複数の相同遺伝子が明らかになりましたが、対応するショウジョウバエのORには遺伝子が1つしかありません（補足図1）。。

B. dorsalis OR 遺伝子の発現プロファイルは、qPCR によって異なる B. dorsalis 身体部分の 7 つの組織をテストすることによって調査されました (補足図 2)。ほとんどの遺伝子は、上顎触診、頭部表皮、特に触角などの感覚子が豊富な組織で強く発現されていました。 BdorOR7a-4、BdorOR19a、BdorOR24a、BdorOR47b、BdorOR94a-2 などのいくつかの遺伝子も口吻で発現されました。生後15日の処女雌と交配した雌の遺伝子発現プロファイルを比較したところ、交配後に有意に上方制御された20個の遺伝子と大幅に下方制御された5つの遺伝子が明らかになりました（補足図3）。妊娠中の雌が 1-オクテン-3-オールに対してより感受性が高いことを考慮して、20 個の上方制御された OR 遺伝子を 1-オクテン-3-オール結合親和性の分析の候補として検討しました。

どのB. dorsalis ORが主に1-オクテン-3-オールの認識に関与しているかを決定するために、20の候補すべてをコレセプター遺伝子BdorOrcoとともにアフリカツメガエル卵母細胞で発現させ、2電極電圧クランプシステムを使用して1-オクテン-3-オールに対する応答を記録します。水を注入された対照卵母細胞は、DMSOまたは1-オクテン-3-オールのいずれかをチャレンジしても検出可能な電流を生成しませんでした（図2a）。 20の候補ORのうち、BdorOR7a-6 / BdorOrcoまたはBdorOR13a / BdorOrcoを発現する卵母細胞のみが1-オクテン-3-オールによって明らかに活性化され、どちらの場合も用量依存的な電流が観察されました（図2b、c）。ベースラインと最大値の中間に反応を誘導する 1-オクテン-3-オールの最大半値有効濃度 (EC50 値) は、BdorOR7a-6/BdorOrco では 105 μM、BdorOR13a/BdorOrco では 1.268 μM でした。したがって、BdorOR13a は、1-オクテン-3-オールに対して BdorOR7a-6 よりもはるかに高い親和性を有すると考えられます。

a – c BdorOR7a-6/BdorOrco または BdorOR13a/BdorOrco を共発現するアフリカツメガエル卵母細胞の 1-オクテン-3-オールに対する反応。 a アフリカツメガエルの卵母細胞に適切な構築物を注入し、さまざまな濃度の 1-オクテン-3-オールで刺激しました。卵母細胞に、(i) 対照としての水、(ii) BdorOR7a-6/BdorOrco の cRNA、(iii) BdorOR13a/BdorOrco の cRNA を注入しました。 b 1-オクテン-3-オールに対するBdorOR7a-6の用量反応曲線。 EC50 = 1.05 × 10−4 M。 c 1-オクテン-3-オールに対する BdorOR13a の用量反応曲線。 EC50 = 1.268 × 10−6 M。記号は、BdorOR/BdorOrco 複合体からの現在の応答を平均値 ± SE (n = 8) として示します。用量反応曲線は、GraphPad 8.0 を使用してフィッティングされました。 d – h BdorOR7a-6/BdorOrco または BdorOR13a/BdorOrco を共発現する HEK 293 細胞の 1-オクテン-3-オールに対する応答。 d Fluo4-AM とインキュベートし、候補 OR 遺伝子をトランスフェクトした HEK 293 細胞の蛍光画像。 Fluo4-AM を使用して経時的な蛍光変化 (ΔF) を示し、mCherry をレポーターとして使用して、トランスフェクトに成功した細胞を観察しました。比例スケールは50μmです。 e 10-4 Mの1-オクテン-3-オールによる刺激後のBdorOR7a-6/BdorOrcoを発現する細胞の蛍光強度の変化。 f BdorOR7a-6 の 1-オクテン-3-オールに対する用量反応曲線。 EC50 = 1.561 × 10-5 M.g 10-4 M の 1-オクテン-3-オールによる刺激後の BdorOR13a/BdorOrco を発現する細胞の蛍光強度の変化。 h 1-オクテン-3-オールに対するBdorOR13aの用量反応曲線。 EC50 = 1.128 × 10−5 M。

2 電極電圧クランプデータを確認するために、HEK 293 細胞で OR を発現させ、カルシウムイメージングによって 1-オクテン-3-オールに結合する OR の能力を検出しました。 Fluo-4 AMとインキュベートした細胞は488 nmで励起すると緑色でしたが、ORコンストラクトと視覚マーカーmCherryで正常にトランスフェクトされた細胞は555 nmで励起すると赤色でした（図2d）。 BdorOR7a-6 / BdorOrco または BdorOR13a / BdorOrco でトランスフェクトされた細胞のみが、10-4 M 1-オクテン-3-オールでの刺激後に緑色蛍光強度の有意な変化を示し（図2e、g）、濃度応答曲線が明らかになりました。 BdorOR7a-6/BdorOrcoのEC50値は15.6μM、BdorOR13a/BdorOrcoのEC50値は11.3μM（図2f、h）。

我々は、BdorOR7a-6 および BdorOR13a 遺伝子に対する gRNA を設計し、それらを精製 Cas9 タンパク質とともに産まれたばかりの B. dorsalis 卵に注入して、ノックアウト変異を生成しました。 BdorOR7a-6 および BdorOR13a の標的部位は、それぞれ第 1 エクソンと第 2 エクソンに位置しました (図 3b、c)。 BdorOR7a-6 グループでは 26 名の成人、BdorOR13a グループでは 12 名の成人を採取しました。モザイクG0個体は多型の解析に基づいて同定され、G0変異効率はそれぞれ13％と22％であることが判明した（図3a）。 TA クローニングとサンガー配列決定により、G0 BdorOR7a-6-/+ 変異体では 3 つの遺伝子型が、G0 BdorOR13a-/+ 変異体では 2 つの遺伝子型が明らかになりました。変異体は個別に野生型（WT）ハエと交配され、潜在的なオフターゲット変異を排除するために、G1 子孫は少なくとも 10 世代にわたって WT ハエに戻し交配されました。最後に、ホモ接合性 4 bp 欠失を持つ BdorOR7a-6-/- ハエとホモ接合性 7 bp 欠失を持つ BdorOR13a-/- ハエを取得しました (図 3b、c)。変異体の BdorOR7a-6 アミノ酸配列は 236 位から変更され、254 位に終止コドンが作成されました (394 残基の WT タンパク質と比較)。変異体の BdorOR13a アミノ酸配列は 127 位から変更され、172 位に終止コドンが作成されました (441 残基の WT タンパク質と比較)。

a マイクロインジェクション後の生存率と突然変異誘発率。 b BdorOR7a-6 のターゲット領域。 (i) ゲノム配列に基づく BdorOR7a-6 の遺伝子構造。エクソンは灰色のボックスで示され、イントロンは線で示されます。最初のエクソンの gRNA ターゲットには 20 nt のガイド配列が含まれており、緑色で強調表示されている隣接する CGG はプロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) です。 (ii) G0 変異体の遺伝子型は、TA クローニングおよびサンガー配列決定によって決定されました (欠失は黄色で強調表示されたダッシュとして示されています)。モザイク G0 ハエに割り当てられた識別子は各配列の先頭に示され、欠失したヌクレオチドの数は各配列の後に示されます。 (iii) WT、BdorOR7a-6-/+、およびBdorOR7a-6-/- ハエのサンガー配列トレース。黒い領域は gRNA の標的部位です。 (iv) BdorOR7a-6 WT および変異体 (-4 bp) 対立遺伝子の予測タンパク質配列。 c BdorOR13a の標的領域。(i-iv) は、上記の BdorOR7a-6 変異体で提供されたものと同じ詳細を示します。

我々は、1-オクテン-3-オールおよびその他の揮発性物質に対する変異体ハエと野生型ハエの電気生理学的反応を電気アンテナグラフィー（EAG）によって比較した。 WT ハエの平均 EAG 応答は 1-オクテン-3-オールの濃度とともに徐々に増加し (図 4a)、10% (v/v) 1-オクテン-3-オールで 3.829 ± 0.33 mV のピークに達しました。変異体の平均 EAG 応答は、WT ハエと比較して、0.1%、1%、および 10% (v/v) 1-オクテン-3-オールで有意に低かった。さらに、BdorOR13a-/- 変異体のEAG応答は、1%および10% (v/v) 1-オクテン-3-オールではBdorOR7a-6-/- 変異体のEAG応答よりも低かった。しかし、他の 3 つの揮発性物質 (チグリ酸エチル、酢酸エチル、酪酸エチル) に対する BdorOR7a-6-/- および BdorOR13a-/- 変異体の EAG 応答は、WT ハエと比較して有意な差を示さなかった。

a 異なる濃度の1-オクテン-3-オールおよび他の揮発性物質に対するWT、BdorOR7a-6-/-およびBdorOR13a-/-変異体のEAG応答。データは平均値 ± SE (n = 15 ～ 20) です。統計的有意性は、スチューデントの t 検定を使用して決定されました (*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001)。 b WTおよび変異雌における1-オクテン-3-オールによって誘発される産卵行動。ヒートマップには、足跡の密度と 8 人の女性が費やした時間が示されており、赤が最も密度が高いことを示しています。画像は 24 時間後の産卵の範囲を示し、ヒストグラムは各ハエが産んだ卵の平均数を示します。データは平均値 ± SE (n ≥ 8 の生物学的複製) です。統計的有意性は、スチューデントの t 検定を使用して決定されました (***p < 0.001)。

上記と同じ実験設定を使用して、WTおよび変異雌に対する誘引物質としての1-オクテン-3-オールの効率を比較するために、産卵バイオアッセイを実施しました（図1c）。 1-オクテン-3-オール部位で各 WT メスが産んだ卵の平均数は 28 ± 3 (n = 12) であったのに対し、MO で処理した部位ではほぼ 0 (n = 12) でした (p < 0.001) 、スチューデントの t 検定、図 4b)。しかし、変異体ハエが1-オクテン-3-オール部位に産んだ卵の平均数は有意に少なく、BdorOR7a-6の場合は4±1個（n = 13、p < 0.001、スチューデントのt検定、図4b）でした。 -/- 変異体、および BdorOR13a-/- 変異体については 2 ± 1 (n = 16、p < 0.001、スチューデントの t 検定、図 4b)。 MO部位ではWTハエと変異ハエの間に有意差はなかった。さらに、BdorOR7a-6-/- および BdorOR13a-/- 変異体の軌跡は、誘引物質の周囲に集中した WT 軌跡とは対照的に、乱れており、ペトリ皿全体を覆っていました。 BdorOR7a-6-/- および BdorOR13a-/- 変異体の動作は、補足ムービー 5 ～ 6 に示されています。

AlphaFold 2.0を使用して、BdorOR7a-6およびBdorOR13aの構造を予測しました（図5a、c）。予測の精度は、PROCHECK ラマチャンドランプロットを使用して評価され、BdorOR7a-6 残基の 96.7% が優先領域 (A、B、L) に配置され、禁止領域には残基が配置されていないことが明らかになりました (補足図 4a)。同様に、BdorOR13a 残基の 95.3% が優先領域に配置され、不許可領域には残基が配置されませんでした (補足図 4b)。分子ドッキングにより、BdorOR7a-6 と BdorOR13a は 1-オクテン-3-オールに結合する細長いポケット状の空洞を特徴とすることが示されました。 BdorOR7a-6の残基Asn86（図5b）、およびBdorOR13aの残基Asp320およびLys323（図5d）は、1-オクテン-3-オールと水素結合を形成すると予測されました。 3 つの結合部位の正確性は、各部位を個別にアラニンで置換する部位特異的突然変異誘発によって決定されました。 3 つの変異配列を BdorOrco 構築物とともに HEK 293 細胞にトランスフェクトし、続いて上記のようにカルシウムイメージングを行いました。変異 Asn86Ala は、1-オクテン-3-オールに対する BdorOR7a-6 の結合親和性を大幅に低下させ、EC50 値を 46.7 μM に増加させました。変異Lys323AlaおよびAsp320Alaは、BdorOR13aの1-オクテン-3-オールに結合する能力を無効にし、いずれの場合もEC50値を記録することを不可能にしました（図5e、f）。さらに、分子ドッキングの結果は、3つの変異が1-オクテン-3-オールと水素結合を形成できないことを示しました（補足図5〜6）。

AlphaFold 2.0 を使用して予測された BdorOR7a-6 の構造。 b 1-オクテン-3-オールへの結合に必要なBdorOR7a-6の残基。 c AlphaFold 2.0を使用して予測されたBdorOR13aの構造。 d 1-オクテン-3-オールへの結合に必要なBdorOR13aの残基。 e カルシウムイメージングに基づく、1-オクテン-3-オールに対するBdorOR7a-6 Asn86Ala変異体の応答。 f カルシウムイメージングに基づく、1-オクテン-3-オールに対するBdorOR13a Asp320AlaおよびLys323Ala変異体の応答。

B. dorsalis に対して広く使用されている市販の誘引物質の主成分はメチルオイゲノールで、これは雄を強く誘引しますが、雌を誘引しません 21。野外では、オスの誘引は、妊娠中のメスによる産卵とその後の幼虫による被害を妨げないため、交尾後に有益な効果をもたらしません。したがって、B. dorsalis の制御を成功させるには、交尾破壊または雌誘引物質のいずれかが必要です。妊娠中のメスは熟したマンゴー果実に産卵することを好み7、8、9、10、1-オクテン-3-オールはこの産卵行動を導く可能性のある嗅覚信号の1つとして提案されています11、12。私たちは、1-オクテン-3-オールが未婚の雌よりも交尾した雌に対してより魅力的であり、雌誘引物質の開発にとって理想的な候補であることを発見しました。興味深いことに、マンゴーと 1-オクテン-3-オールが代替選択肢として提供された場合、1-オクテン-3-オールが好まれ、また、妊娠中のメスがより多くの卵を産むように誘導されました。これは、1-オクテン-3-オールがメスを誘引するだけでなく、産卵活動も刺激することを示しています。

BdorOrco-/- 変異体は EAG 実験では 1-オクテン-3-オールに反応せず、我々の以前の研究では産卵行動に重大な変化を示しました 20。昆虫の嗅覚刺激には Orco が厳密に必要であることを考えると、1-オクテン-3-オールによって導かれる産卵行動は OR によって媒介されるに違いありません。 1-オクテン-3-オールの OR を同定する試みがいくつか行われてきましたが、高品質のゲノム配列が不足しているため、その認識の分子基盤はこれまでほとんど不明のままでした 16。したがって、我々は、高品質のゲノムアセンブリといくつかのトランスクリプトームデータベースを使用して、B. dorsalis OR 遺伝子に注釈を付けました。我々は、これまでで最も包括的なリポジトリである 74 個の B. dorsalis OR 候補遺伝子を発見し、そのうち 64 個を RT-PCR によってクローニングし、サンガー配列決定によって確認しました。これらのデータは、将来さらに多くの OR の機能特性を評価するための強固な基盤を提供します。 B. dorsalis および D. melanogaster からの OR の系統解析により、いくつかの直接オルソログが明らかになりましたが、以前に報告されているように 16、植物揮発性物質などの環境臭気物質への適応を反映する遺伝子重複および分岐の他のケースも明らかになりました。これらの相同な OR が特定の臭気物質または類似の臭気物質のセットの知覚に関与しているかどうかを判断することは興味深いでしょう。 B. dorsalis OR 遺伝子は、D. melanogaster について以前に報告されているように、主に嗅覚器官で発現します22。揮発性物質に対する性的二型反応は B. dorsalis で報告されています 21,23,24 が、以前の結果と一致して、雄と雌の間に有意なトランスクリプトームの違いは観察されませんでした 16。

昆虫にとって交尾状態は重要なスイッチであり、昆虫が産卵行動を引き起こす産卵準備状態に入ることができます25。たとえば、地中海ミバエ Ceratitis capitata の交尾したメスは、オスのフェロモンから宿主の果実の臭気物質に好みを切り替えます 26。メスの交尾状態は、メスの新たな行動状態や生理学的ニーズとともに、揮発性物質の認識に影響を与えると予測されており 27、したがって、本研究では、1-オクテン-3-オールが処女メスよりも交尾にとって魅力的であることがわかりました。我々は、交配したメスで上方制御されている20個のB. dorsalis OR遺伝子を発見し、それらを1-オクテン-3-オールの認識のための候補ORとみなした。しかし、BdorOR7a-6とBdorOR13aのみが1-オクテン-3に対して有意な応答を示した。 -オル。 BdorOR13a のオルソログは、D. melanogaster 28、Anopheles gambiae 29、および Spodoptera fragiperda 30 においても同様に 1-オクテン-3-オールに応答します。

X.ラエビス卵母細胞、S.フルギペルダ（Sf9）細胞、HEK 293細胞、ショウジョウバエの「空ニューロン」系などの異種発現系は、オーファンORのリガンドを同定するために使用されている31。電圧クランプ記録は、BdorOR7a-6 が BdorOR13a よりも有意に大きい EC50 値を有することを示しましたが、カルシウムイメージングでは受容体間に有意な差が示されませんでした。これらの不一致な結果は、各異種システムの固有の特性および/または測定技術の違いを反映している可能性があります 32。さらに、他の研究における電圧クランプ記録の結果は、BdorOR7a-6 が他の 2 つの揮発性物質に応答できることを示し、BdorOR7a-6 が BdorOR13a と比較してホスト揮発性物質に幅広く調整されていることを示しました。

1-オクテン-3-オールによって誘発される産卵挙動は、BdorOR7a-6-/- 変異体および BdorOR13a-/- 変異体において著しく変化した。 1-オクテン-3-オールによる刺激後、妊娠中の変異体メスが産む卵の数は野生型ハエよりもはるかに少なく、1-オクテン-3-オールに対する嗅覚感度の低下により変異体ハエの進路も乱れた。ビデオ S1 ～ S4 では、WT 雌が 1-オクテン-3-オールを素早く見つけてその周囲に卵を産むのに対し、変異体は多くの場合 1-オクテン-3-オールを見つけることができなかったことが示されています。しかし、メスは依然として MO よりも 1-オクテン-3-オール処理側にかなり多くの卵を産みました。ダブルノックアウトを行わなかったことを考えると、これは理にかなっています。したがって、もう一方の OR が部分的に産卵を助けることができます。したがって、BdorOR13a と BdorOR7a-6 は 1-オクテン-3-オールに調整されているようで、これが産卵行動を調節しています。これは、受容体 CquiOR37 および CquiOR99 が 2 つの産卵誘引物質 (4-メチルフェノールおよび 4-エチルフェノール) に狭く調整されている蚊の Culex quinquefasciatus での発見と一致していますが、この優先性は変異体 CquiOR37-/- および CquiOR99-/- では失われています。 33. したがって、臭気物質による産卵行動には、OR 依存の嗅覚反応が必要です。 BdorOR7a-6-/- および BdorOR13a-/- 変異体も、WT ハエよりも 1-オクテン-3-オールに対する有意に低い EAG 応答を示し、BdorOR13a-/- 変異体が最大の欠損を示しました。電圧クランプアッセイにおける BdorOR13a (1.27 μM) の EC50 値も、BdorOR7a-6 (105 μM) の EC50 値よりもはるかに低かった。これらのデータは、各受容体が他の受容体のノックアウトを部分的に補うことができるが、BdorOR13a が 1-オクテン-3-オールの知覚に対する主要な OR であることを示唆しています。

部位特異的突然変異誘発は、昆虫の OR と臭気物質の結合特性を調べるために使用できます 34、35、36。この研究では、BdorOR13a の Asp320Ala および Lys323Ala 変異体は 1-オクテン-3-オールに結合できず、この変異により結合ポケットの立体構造が変化したことが示唆されました。 BdorOR7a-6 の Asn86Ala 変異体は、1-オクテン-3-オールに結合する能力を保持していましたが、結合親和性ははるかに低く、結合部位のコンパクトな構造が緩和された可能性があることを示しています 37。同様の結果が、Ostrinia furnacalis38、D.melanogaster39、A.gambiae40でも報告されています。我々の結果は、OR の立体構造が単一アミノ酸の置換によって影響を受けること、および BdorOR13a の Asp320 および Lys323 残基が 1-オクテン-3-オール結合の絶対要件であることを示しています。 OR の構造をさらに解析することで、臭気物質の結合に関与する構造変化についてのさらなる洞察が得られ、より高い親和性で OR に結合することで B. dorsalis をより効率的に誘引する臭気物質のスクリーニングが容易になる可能性があります。

結論として、我々は、1-オクテン-3-オールが妊娠中のB. dorsalis雌にとって強力な誘引物質であり、産卵行動も調節していることを発見した。我々は、B. dorsalis OR のゲノムワイドなアノテーションを完了し、in vitro 結合アッセイとゲノム編集、その後の行動試験を使用して、2 つの受容体 (BdorOR13a および BdorOR7a-6) が 1-オクテン-3-オールに調整されていることを示しました。我々の結果は、1-オクテン-3-オールが妊娠中のB. dorsalis 雌を誘引する可能性があることを示すだけでなく、その認識の分子基盤も明らかにします。これにより、果樹作物に対する B. dorsalis の影響を軽減するための、より強力な雌性誘引物質の開発が促進される可能性があります。

WT B. dorsalis は、2008 年に中国海南省海口市から収集されました。これらは、重慶市の昆虫学および害虫防除工学の主要研究所で、27 ± 1 °C、相対湿度 70 ± 5%、14 度の環境で維持されました。 h 光周期。成虫は、蜂蜜、砂糖、酵母粉末、ビタミン C を含む人工飼料で飼育されました。孵化したばかりの幼虫は、トウモロコシと小麦胚芽粉、酵母粉末、寒天、砂糖、ソルビン酸、リノール酸、およびビタミン C を含む人工飼料に移されました。濾紙。

ダブルトラップルアーアッセイは、側壁に均等に分散された穴（直径 = 1.5 mm）を持つ 20 × 20 × 20 cm の透明なケージ内で、妊娠中の雌と処女の雌の嗅覚の好みを比較するために設定されました。トラップは逆さの 50 mL 遠心分離管から再取り付けされ、ケージの対角線に沿って配置されました。各トラップの上部に 1 mL ピペットチップを突き刺しました。ハエがピペットからトラップに確実にアクセスできるように短くしました。マンゴーを用いた嗅覚嗜好性アッセイでは、200 μL PCR チューブのキャップ内で、1 つのトラップに 60 mg のマンゴー果肉を充填し、もう 1 つのトラップに 20 μL MO を充填しました。 1-オクテン-3-オール (≥98%、シグマ、米国) を使用した嗅覚選好性アッセイでは、1 つのトラップに MO で希釈した 20 μL 10% (v/v) 1-オクテン-3-オールをロードしました。他には 20 μL MO を使用します。ハエに水を与えるために、水に浸した綿球をケージの中央に置いた。各実験のために 30 匹のメスのハエのグループをケージに導入し、各実験を繰り返して 8 つの生物学的複製を提供しました。概日リズムの一貫性を確保するために、すべての実験は午前 10 時に開始されました。各トラップ内のハエの数を 2 時間ごとに 24 時間カウントしました。生後 3 日の未成熟メス、生後 15 日の未成熟メス、および生後 15 日の交尾メスの好みを比較しました。嗅覚選好指数は、次の式41を使用して計算されました：（マンゴー/臭気物質トラップ内のハエの数 – 対照トラップ内のハエの数）/ハエの総数。

産卵行動は、上記のように側壁に均等に分散された穴を備えた 10 × 10 × 10 cm の透明なケージ内で監視されました。 1% 寒天を満たした 9 cm ペトリ皿を産卵基質として使用し、マンゴー果肉、10% (v/v) 1-オクテン-3-オールまたは MO を皿の反対側の端に加えました。我々は、さまざまな基質に対するハエの好みをテストしました。(1) 一方の端に約 60 mg のマンゴー果肉、もう一方の端に 20 μL の MO。 (2) 一方の端に 20 μL の 1-オクテン-3-オール、もう一方の端に 20 μL の MO。 (3) 一方の端に約 60 mg のマンゴー果肉、もう一方の端に 20 μL の 1-オクテン-3-オール。 (4) 片面に約 60 mg のマンゴー果肉と 20 μL の 1-オクテン-3-オール、もう一方の片面に約 60 mg のマンゴー果肉と 20 μL の MO。寒天ディスクは果物の皮を模倣する穴の開いたプラスチックのラップで覆われ、ハエが産卵管をプラスチックのラップの中に伸ばして卵を産むのを促しました。寒天ディスクをケージの中央に置き、生後 15 日の妊娠雌 8 匹を導入しました。 2 台の Sony FDR-AX40 カメラがハエの行動を 24 時間記録し、1 台は足跡を記録するためにケージの上に固定され、もう 1 台は産卵行動を記録するためにケージの前に設置されました。ダブルトラップ誘引アッセイの結果に基づいて、観察エリア（ペトリ皿の表面）内のすべてのハエの足跡と滞在時間を分析するために、ビデオの 3 時間（6 ～ 9 時間）が選択されました。ビデオは EthoVision XT v16 (Noldus Information Technology) を使用して分析され、すべてのハエが各側で費やした合計時間 (秒単位) と合計移動距離 (センチメートル単位) が決定され、軌跡がヒートマップの形式で視覚化されました 17。各実験で 8 匹のハエが産んだ卵の数は CNOPTEC 実体顕微鏡で数えられ、各実験グループは 7 ～ 16 個の反復で構成されました。

国立バイオテクノロジー情報センター (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) からダウンロードした D. melanogaster のアミノ酸配列を、同一性カットオフを使用して B. dorsalis アミノ酸データベースに対する BLASTP クエリとして使用しました。 30%。候補 OR 遺伝子は、B. dorsalis アンテナ 42、上顎触肢および口吻、およびその他の組織からのディープトランスクリプトームデータと比較されました。

高忠実度のPrimerSTAR Max DNAポリメラーゼ（TaKaRa、大連、中国）を使用して、B. dorsalisのゲノムデータに従って設計されたプライマー（補足表2）を使用したネステッドPCRによってBdorOR遺伝子の完全なオープンリーディングフレームを増幅しました。各 25 μL 反応には、12.5 μL 2 × PrimerSTAR Max Premix (TaKaRa)、10.5 μL の超純水、1 μL の各プライマー (10 μM)、および 1 μL の cDNA テンプレートが含まれていました。 98 °C で 2 分間の最初の変性ステップに続いて、98 °C で 10 秒、55 °C で 15 秒、72 °C で 90 秒のサイクルを 35 サイクル行い、最終伸長ステップは 72 °C で 10 分間でした。。精製したPCR産物を、配列決定のためにベクターpGEM-T Easy（Promega、ウィスコンシン州マディソン）に移した（BGI、北京、中国）。

全 RNA は、(i) 雄と雌の触角、上顎触診、頭部表皮 (触覚、上顎触診、および口吻を除く)、口吻、脚、羽および産卵管、および (ii) 生後 15 日の頭部から抽出されました。 TRIzol 試薬 (Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド) を使用して、処女メスと交配メスを比較しました。ゲノム DNA を RNase-free DNase I (Promega) で除去し、PrimeScript RT 試薬キット (TaKaRa) を使用して 1 μg のトータル RNA からファーストストランド cDNA を合成しました。標準曲線を使用して、cDNA の 5 倍連続希釈によるプライマー効率 (補足表 3) を評価しました。定量的リアルタイム PCR (qRT-PCR) は、CFX Connect Real-Time System (Bio-Rad、Hercules、CA) を使用し、5 μL SYBR Supermix (Novoprotein、上海、中国) を含む 10 μL の総反応量で実行されました。、3.9 μL ヌクレアーゼフリー水、0.5 μL cDNA (約 200 ng/μL)、および 0.3 μL のフォワードおよびリバースプライマー (10 μM)。 α-チューブリン (GenBank: GU269902) およびリボソームタンパク質 S3 (GenBank: XM_011212815) を内部参照遺伝子として使用しました。各実験に対して 4 つの生物学的複製を準備しました。相対発現レベルは 2-ΔΔCt 法 43 を使用して決定され、データは SPSS v20.0 (IBM) を使用して分析されました。

候補 B. ドルサリス OR 遺伝子および BdorOrco を表す検証済みの PCR 産物を、卵母細胞での発現のためにベクター pT7T に移しました。 mMESSAGE mMACHINE T7 キット (Invitrogen、リトアニア) を使用して、cRNA を合成するためにプラスミドを線状化しました。精製した cRNA を 2 μg/μL に希釈し、約 60 ng の cRNA を X. laevis 卵母細胞に注入しました。卵母細胞を、洗浄緩衝液（96 mM NaCl、5 mM MgCl2、2 mM KCl、5 mM HEPES、pH 7.6）中で 1.5 mg/mL コラゲナーゼ I（GIBCO、カリフォルニア州カールズバッド）で 30 ～ 40 分間、室温で前処理しました。注入前の温度。リンガー液 (96 mM NaCl、5 mM MgCl2、2 mM KCl、5 mM HEPES、0.8 mM CaCl2) 中で 18 °C で 2 日間インキュベートした後、卵母細胞をさまざまな濃度の 1-オクテン-3-オールで希釈したものに曝露しました。 DMSO中の1Mストックからのリンゲル液中で。臭気物質によって誘導される全細胞内向き電流は、2 電極電圧クランプと OC-725C アンプ (Warner Instruments、コネチカット州ハムデン) を使用して、保持電位 –80 mV で注入された卵母細胞から記録されました。信号は 50 Hz のローパスフィルターを使用して処理され、1 kHz でデジタル化されました。ヌクレアーゼフリー水を注入した卵母細胞を陰性対照として使用した。データは、Digidata 1550 Aデバイス(Warner Instruments、コネチカット州ハムデン)を使用して取得し、pCLAMP10.5ソフトウェア(Axon Instruments Inc.、カリフォルニア州ユニオンシティ)を使用して分析した。

候補 B. dorsalis OR 遺伝子および BdorOrco を表す検証済みの PCR 産物を、トランスフェクションを確認するために赤色蛍光を与える mCherry タグとともにベクター pcDNA3.1(+) に移しました。高品質のプラスミド DNA は、Qiagen プラスミド MIDIprep キット (QIAgen、デュッセルドルフ、ドイツ) を使用して調製されました。 B. dorsalis OR および BdorOrco プラスミドを、96 ウェルプレート中で TransIT-LT1 トランスフェクション試薬 (Mirus Bio LLC、日本) を使用して HEK 293 細胞に同時トランスフェクトしました。蛍光色素 Fluo-4 AM (Invitrogen) を DMSO 中の 1 mM ストックとして調製し、ハンクス平衡塩類溶液 (HBSS、Invitrogen、リトアニア) で 2.5 μM に希釈して、カルシウム指示薬として機能させました。トランスフェクションの 24 ～ 30 時間後に細胞培地を除去し、細胞を HBSS で 3 回洗浄した後、Fluo 4-AM を添加して暗所で 1 時間細胞をインキュベートしました。 HBSSで3回洗浄した後、99μLの新鮮なHBSSを各ウェルに加え、1μLの希釈1-オクテン-3-オールを用いて暗所で試験した。蛍光画像はレーザー走査型共焦点顕微鏡 (Zeiss、ドイツ) で取得しました。 Fluo 4-AM は 488 nm で励起され、mCherry は 555 nm で励起されました。蛍光の相対変化 (ΔF/F0) を Ca2+ の変化を表すために使用しました。ここで、F0 はベースライン蛍光、ΔF は 1-オクテン-3-オール刺激によって誘発されたピーク蛍光とベースラインの差です。正常にトランスフェクトされた健康な細胞 (555 nm で励起すると赤色) を分析に使用しました。最終濃度 10-4 M を最初に使用して、対応する OR をスクリーニングし、次に、異なる濃度の 1-オクテン-3-オールによる刺激に対するスクリーニングされた OR の応答を決定しました。 1-オクテン-3-オールの各濃度を 3 回繰り返してテストしました。濃度反応曲線は、GraphPad Prism v8.0 (GraphPad Software) を使用して作成されました。

BdorOR7a-6 および BdorOR13a のエクソン配列は、高品質の B. dorsalis ゲノムアセンブリを使用して予測されました。各 gRNA 配列は、長さ 20 ヌクレオチドにプロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) としての NGG を加えたものでした。オフターゲット変異の可能性は、CasOT を使用して B. dorsalis ゲノム配列をスクリーニングすることによって評価されました。各 gRNA は、GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit (Invitrogen) を使用して合成し、GeneArt gRNA Clean-up Kit (Invitrogen) を使用して精製しました。胚は前述のように顕微注入されました20。 GeneArt Platinum Cas9 Nuclease Kit (Invitrogen) からの精製 gRNA と Cas9 タンパク質を混合し、最終濃度がそれぞれ 600 ng/μL と 500 ng/μL になるように希釈しました。新鮮な卵 (20 分以内に産まれたもの) を収集し、1% 次亜塩素酸ナトリウムに 90 秒間曝露して絨毛膜を軟化させました。卵をスライドガラス上に固定し、IM-300 デバイス (Narishige、東京、日本) とモデル P-97 マイクロピペットプーラー (Sutter Instrument Co.、カリフォルニア州ノバト）。ネガティブコントロールとしてヌクレアーゼフリー水を卵に注入しました。注射は２時間以内に完了した。注入された胚は 27 °C のインキュベーターで培養され、その後の発生中の死亡率が記録されました。

G0 変異体は、以前に記載されているようにスクリーニングされました 20。 G0 成体の生存者を個別に WT ハエ (一対) に戻し交配して、G1 の子孫を収集しました。 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) を使用して、産卵後の G0 個体からゲノム DNA を抽出しました。各 gRNA ターゲットの周囲の領域は、抽出した DNA をテンプレートとして使用し、補足表 2 に記載の特定のプライマー、および 2 × Taq PCR MasterMix (Biomed、北京、中国) を使用して PCR によって増幅しました。 PCR産物は、QIAxcel DNA High Resolution Kit (Qiagen)を使用したキャピラリー電気泳動によって分析されました。 WT 対立遺伝子とは異なる PCR 産物を精製し、配列決定のためにベクター pGEM-T Easy に移しました。突然変異が遺伝したことを確認するために、InstaGene Matrix (Bio-Rad、カリフォルニア州ハーキュリーズ) を使用して G1 ハエの 1 本の中胸脚からもゲノム DNA を抽出し、上記のように分析しました。潜在的なオフターゲット変異を回避するために、ヘテロ接合性 G1 変異体を 10 世代以上前に WT ハエに戻し交雑してから、自家交雑してホモ接合性変異ハエを生成しました。

1-オクテン-3-オールに対する生後 15 日齢の B. dorsalis 成虫の触角反応は、以前に報告されているように EAG 記録 (Syntech、オランダ) によって測定されました 20。簡単に説明すると、Spectra 360 電極ゲル (Parker、Fairfield、NJ、USA) を使用してアンテナを 2 つの電極に固定しました。シグナル応答は IDAC4 デバイスを使用して増幅され、EAG-2000 ソフトウェア (Syntech) を使用して収集されました。各実験の前に、1-オクテン-3-オールと他の 3 つの揮発性物質 (チグレートエチル、酢酸エチル、酪酸エチル) を MO で 10%、1%、0.1% (v/v) に希釈し、電気生理学的刺激として使用しました。 MOをネガティブコントロールとして使用しました。コントローラー (Syntech) を使用して一定の空気流 (100 mL/分) を生成し、アンテナを刺激しました。次に、各希釈液または MO の 10 μL を濾紙 (5 × 1 cm) に置き、希釈した臭気物質の前後にネガティブコントロール (MO) を適用して、応答シグナルを校正しました。各濃度での EAG 応答は 15 ～ 20 個のアンテナについて記録され、各濃度は 2 回記録されました。各テストは 1 秒継続し、テスト間の間隔は 30 秒でした。希釈臭気物質に対する WT および変異ハエからの EAG 応答データを、SPSS v20.0 を使用した Student の t 検定を使用して分析しました。

BdorOR7a-6 および BdorOR13a の三次元構造は、AlphaFold 2.044 を使用してモデル化されました。各タンパク質構造の品質と合理性は、SAVES 6.0 (https://saves.mbi.ucla.edu/) の PROCHECK Ramachandran プロットを使用してオンラインで評価されました。ドッキング解析には AutoDock Vina 1.1.2 を使用し、受容体タンパク質の構造とリガンドの分子構造は AutoDock 4.2.6 で前処理しました。ドッキングパラメータはタンパク質の構造と活性部位に従って設定され、最適なドッキングモデルは親和性（kcal/mol）に基づいて選択されました。ドッキングモデルは、分析と画像処理のために Pymol と Discovery Studio 2016 クライアントにインポートされました。分子ドッキングデータに基づいて、補足表 2 にリストされているプライマーを使用した部位特異的突然変異誘発 45 により、3 つの残基 (OR7a-6 の Asn86、OR13a の Asp320、および Lys323) がアラニンに置き換えられました。カルシウムイメージングアッセイと変異タンパク質の分子ドッキングその後、上記のように実行されました。

嗅覚選好性アッセイ、産卵バイオアッセイ、発現プロファイル分析、EAG 記録アッセイのすべては、SPSS v20.0 (IBM) を使用した Student の t 検定 (*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001) を使用して分析されました。）。図は、GraphPad v8.0 (GraphPad ソフトウェア) を使用して生成されました。各アッセイのサンプルサイズは原稿に記載されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

最終的な染色体アセンブリゲノムデータと上顎触診およびその他の組織のトランスクリプトームデータは、それぞれアセンブリアクセッション番号 CNP0003192、CNP0003333、および CNP0003334 で CNGBdb に提出されました。アンテナのディープトランスクリプトームデータは、受託番号 SRR9026238 で国立バイオテクノロジー情報センターシークエンスリードアーカイブ (SRA) に寄託されました。

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この研究は、中国国家重点研究開発プログラム（2021YFC2600100、2022YFC2601000）、中国国家自然科学財団（U21A20222、32072491）、MOFとMARAの中国農業研究システム（CARS-26）からの資金提供によって支援された。

Li Xu、Hong-Bo Jiang などの著者も同様に貢献しました。

400716 中国、重慶、西南大学植物保護学部、昆虫学および害虫防除工学の主要研究室

Li Xu、Hong-Bo Jiang、Jie-Ling Yu、Deng Pan、Yong Tao、Quan Lei、Yang Chen、Zhao Liu、Jin-Jun Wang

中国重慶市、西南大学農業科学院、南部山岳地帯作物ストレス生物学国家栽培基地

Li Xu、Hong-Bo Jiang、Jie-Ling Yu、Deng Pan、Yong Tao、Quan Lei、Yang Chen、Zhao Liu、Jin-Jun Wang

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LX、HJ、ZL、JW が研究を設計しました。 LX、JY、QL が調査を実施しました。 LX、DP、YT がデータを分析しました。 LX、HJ、JW が論文を書きました。 YC は野生型ハエを飼育し、変異体ハエをスクリーニングした。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

Jin-Jun Wang への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

動物実験: この研究のすべての手順は、サウスウェスト大学の動物管理使用委員会によって承認されました。アフリカツメガエルは氷に30分間浸漬して麻酔をかけ、感染を避けて苦痛を最小限に抑えるために傷を注意深く治療した。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Dan-Dan Zhang と他の匿名の査読者に感謝します。主な取り扱い編集者: Hannes Schuler および Luke R. Grinham。

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転載と許可

Xu、L.、Jiang、HB、Yu、JL。他。 2 つの臭気物質受容体が、ショウジョウバエの 1-オクテン-3-オール誘発性の産卵行動を制御します。 Commun Biol 6、176 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04551-5

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受信日: 2022 年 8 月 28 日

受理日: 2023 年 2 月 3 日

公開日: 2023 年 2 月 15 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04551-5

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