マイコエンドファイトを使用した MnO NP の新規生合成: 工業的バイオプロセス戦略とスケーリング

Scientific Reports volume 13、記事番号: 2052 (2023) この記事を引用

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この報告書は、キャッピング/還元剤として内生菌トリコデルマビレンス株EG92の細胞外生物活性代謝産物を、親成分としてMnCl2・4H2Oを使用した、平均結晶子サイズが約35 nmの棒状MnO NPの菌合成についての最初の説明を提供します。。内部寄生菌株 EG92 を増殖させるために小麦ふすま培地を選択しました。EG92 株は、細胞外画分にさまざまな生物活性代謝産物を生成し、MnO NP の収量を 9.53 g/l に増加させます。バイオマス生成に影響を与える培地全体と真菌の増殖条件は、連続的な統計的最適化アプローチ (Plackett-Burman および Box-Behnken 設計) として最適化されました。生産性の向上は、pH 5.5、WBE (35%)、および接種材料サイズ (10%) で達成され、Xmax が 12 倍 (89.63 g/l) に増加しました。それにより、Pmax は 8 倍 (82.93 g/l) に増加しました。 162 時間後、μmax および YX/S 側の Xmax (145.63 g/l) および Pmax (99.52 g/l) は、それぞれ 0.084 および 7.65 と測定されました。タグチ実験計画により、真菌で作製した MnO NP 反応は、100% の真菌抽出物 (還元/キャッピング剤) に 0.25 M の MnCl2・4H2O を添加し、反応 pH を ~ 5 に調整することによって改善されました。この反応は 60°でインキュベートされました。２０％真菌抽出物（安定化剤）を添加する前に、５時間℃で静置した。また、Pmax は BC の 40 倍 (395.36 g/l) に上昇しました。当社の菌合成 MnO NP は、真菌よりも植物病原性細菌に対してより迅速かつ正確な拮抗作用を示します。それらは代替品として使用される可能性があり、将来的にはさまざまな種類の病気の病原体を管理するためのナノバイオ農薬が約束されています。

現在、抗生物質、抗がん剤、抗菌剤、バイオ肥料など、さまざまな治療活動や農業活動におけるナノテクノロジーの応用が飛躍的に増加しています1。現代のナノテクノロジーにおける課題の 1 つは、ナノ粒子を合成するための信頼性が高く安全なプロトコルの開発です。非常に多くのナノ粒子やナノ構造を合成する際には、さまざまな物理的および化学的技術が見られます。最近、これらの方法論は、生態系に潜在的なリスクを引き起こす可能性のある安全でない物質への依存により、危険で高価な方法であると報告されました2。したがって、革新的で費用対効果が高く、毒性がなく、環境に優しい持続可能なアプローチを模索することは、非常に重要な課題となるはずです。そこで、グリーンナノテクノロジーは、金属ナノ粒子を製造するための、費用対効果が高く、環境的に持続可能な技術を開発することを提案しました。

Ag、Au、Fe2O3、CaO、MgO、TiO2、ZnO、CuO ナノ粒子など、さまざまな生物源が生合成した多くの金属および金属酸化物のナノ粒子があります 3、4、5、6、7。菌類、細菌、植物、さらには藻類さえも、特に生物医学および農業分野で計り知れない潜在的用途を秘めたナノ粒子を製造するためのグリーンファクトリーとして効果的に使用できます8、9、10。したがって、ナノ粒子のグリーン合成は、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、アルカロイド、フェノール、さらには還元剤や安定化剤として使用される酵素など、生成される生物活性代謝産物によって制御できます。しかし、さまざまな生物源は、その病原性の性質のため、農業分野に適用することができませんでした。したがって、安全な生体細胞から抽出できる安全な生理活性分子を使用することは非常にもっともらしいです2,11。根圏から分離された微生物 (土壌微生物) がいくつかあり、ナノ粒子合成者として主に知られていますが、内部寄生菌 (植物組織微生物) についてはほとんど報告されていません。したがって、抗菌、細胞毒性、抗酸化特性など、さまざまな生物学的用途に魅力的なサイズと形状を備えたさまざまな金属ナノ粒子を生産するナノファクトリーのこれらの有望な生物学的経路に焦点を当てることが重要です12,13。宿主に損傷を与えることなく植物の組織や細胞内で生き続ける細菌、放線菌、真菌などの微生物は、内部寄生菌と呼ばれています。彼らは、生物学とナノテクノロジーに関連した新しい専門的生合成システムを開拓するための魅力的な候補者を検討しました。このアプローチは費用対効果が高く、環境的に持続可能であり、多くの金属イオンを使用せずに、より適切に指定されたサイズと形状のナノ粒子を提供できます 14,15。真菌の内部寄生菌（マイコエンドファイト）、特にトリコデルマ属は、細胞内および細胞外の方法でナノ粒子を生成するための潜在的な供給源として使用できる、さまざまな新規で安全な生理活性代謝物（フラボノイド、アルカロイド、多糖類、酵素）を生成しています。なぜなら、分泌された細胞内および細胞外の生理活性分子は、金属塩を還元し、次に金属イオンを還元することによって、ナノ粒子の生合成（ボトムアップアプローチ）において主要な役割を果たすからである。真菌を介した環境に優しいナノ粒子の製造方法には、バイオマス生産ラインの費用対効果に加えて、発酵プロセスをスケールアップできる簡単さ、下流処理、ナノ粒子を効率的に製造できる可能性など、多くの利点があります。。したがって、さまざまな糸状菌は、さまざまな金属および金属酸化物ナノ粒子の細胞外および細胞内生合成に効果的に適用されています3,16。

いくつかの報告は、植物および細菌抽出物を使用した MnO NP の生合成または (グリーン合成) に興味を持っています。しかし、真菌、特に菌内生菌株から抽出された生理活性代謝産物を使用した MnO NP の生合成を報告した研究はありません。ここで、ナノ粒子のバイオ製造のためのグリーンプロデューサー候補としての真菌細胞の応用は、ナノバイオテクノロジーコミュニティで大きな関心を集めている。また、ナノ粒子の生合成を工業的にスケールアップするために、すべての微生物培養条件に加えて、さまざまな物理化学的パラメーターが最適化され、満足のいく抗菌活性を備えた均質な MnO NP が生成されました。したがって、上記の目的はすべて、熟練した内部寄生菌の 1 つを使用して MnO NP の工業生産ラインを確立するために統計的に研究され、成功しました。

ナノテクノロジーには応用分野に応じて、物理的、化学的、生物学的技術など、ナノ構造材料に対するさまざまなアプローチが含まれます。生物学的作製方法は、物理的および化学的作製方法に伴う副作用を克服する有望な環境に優しい技術として登場して以来8。そこで、植物、藻類、細菌、真菌などの生物学的実体から抽出された生理活性代謝物を使用してナノ粒子が生物学的に製造される、ナノバイオテクノロジーと名付けられたナノテクノロジーの新しい分野が最近登場しました1、9、10、17。この生物学的方法は、医療や農業に応用されるいくつかのナノ粒子を製造するための、商業的に実行可能で、クリーンで、環境に優しく、無毒な技術であると考えられています12,18。作製したナノ粒子をスケールアップするために、ナノテクノロジーの新しい表現が「産業用ナノテクノロジー」と呼ばれました。現在、有毒物質や高エネルギーを使用して人間の健康や環境を破壊することなく、いくつかの産業を発展させるには、ナノ粒子の大規模製造が必須の要件となっています15,19。そこで、産業用ナノバイオテクノロジーと呼ばれる、新たな有望な科学分野が登場しました。本研究で報告されているように、健康リスクの問題と環境上のマイナス面を軽減するために、費用対効果の高い生物学的プロセスが適用されました。

最近、真菌細胞はさまざまな生理活性代謝物を持っているため、いくつかのナノ粒子を製造するための強力なバイオファクトリーとして発見されました。ほとんどの真菌は、必要な栄養素が少なく、扱いやすく、濾過できるため、ナノ粒子製造のためのかなりの投資コストが節約できるため、真菌は他の生物細胞よりも好まれています3。マイコエンドファイト (内部共生生物) は、宿主細胞を破壊することなく植物組織を阻害します。過去数十年間、これらのマイコエンドファイトは、フェノール、ステロイド、フラボノイド、ペプチドなどの生理活性代謝物を無限に生成するため、大きな注目を集めてきました20、21、22。これらの菌内生菌は、ナノ粒子の生合成に使用される混合生理活性代謝産物の潜在的な供給源としては比較的研究されていません 1,8。一方、有望な抗菌剤は有機代謝産物である可能性があります。たとえば、酵素や金属としての無機化合物は、その広範囲の抗菌活性と工業的な大規模加工条件への耐性に応じて異なります5。最近、金属酸化物ナノ粒子は、その形状、サイズ、安定性、および表面特性に応じて食品の安全性における応用の可能性があるため、抗菌剤の潜在的なクラスとして研究されています 16,23,24。特に、MnO NP は、物理的、化学的、電気的、磁気的、および触媒的性質において顕著な特徴を有しており、広範な研究対象となっています。科学レポートのほとんどは、MnO NP の電子特性と触媒活性を使用した応用に加えて、化学的、物理的、触媒特性の推定に焦点を当てていました。しかし、その抗菌活性はほとんど調査されていません24。いくつかの報告は、植物および細菌抽出物を使用した MnO NP の生合成または (グリーン合成) に興味を持っています。しかし、真菌、特に菌内生菌株から抽出された生理活性代謝物を使用した MnO NP の生合成を報告した研究はありません 25。したがって、トリコデルマ属などの安全で安価で最も簡単な潜在的なバイオファクトリーを使用して菌合成されたMnO NPを探索することは、多くの分野、特に農業分野での優れた現代の応用と考えられる新規の抗菌活性を備えています。ここでは、最終的に製造された反応は、色が黄色から赤褐色に変化することで容易に認識できるため、さまざまな菌内生菌分離株を使用して MnO NP を合成しました。続いて、作製した MnO NP を植物病原体に対する抗菌剤としてテストし、抗菌剤として最も効果的な MnO NP を生成する熟練した分離株を選択しました。最も有望な抗菌活性 (P ≤ 0.05) は、Erwinia amylovora (34.0 ± 2.69 mm)、続いて Acetobacter pasturianus (30.0 ± 2.45 mm)、Erwinia persicina (28.5 ± 5.4 mm) などの植物病原性細菌に対して記録されたためです。さらに、菌合成された MnO NP を抗真菌剤としてテストしたところ、Aspergillus flavus (24.5 ± 3.20 mm) および Aspergillus niger (20.5 ± 2.06 mm) に対して最も高い抗真菌活性が測定され、次に Fusarium solani (19.25 ± 3.26 mm) が続きました。結果として、選択された分離株は、GenBank Blast 分析を使用して、指定された rDNA 配列データを使用して遺伝的に同定されました。この分離株は、図 1 に見られるように、トリコデルマビレンスと完全に類似していたため、受託番号 MF429775 を持つ内生菌トリコデルマビレンス EG92 株として GenBank データベースに登録されました。

参照株と比較した、内生菌トリコデルマビレンス EG92 株 (MF429775) における小サブユニットおよび大サブユニットリボソーム RNA 遺伝子 (内部転写スペーサー 1、5.8S リボソーム RNA 遺伝子、および内部転写スペーサー 2) の系統樹および部分配列の多様性。このツリーは、近隣結合および最尤法分析 (MEGA10.1.7 ソフトウェア 2020) を使用して構築されました。配列の相違はスケールバーで示されます。

この研究では、図2B、Cに示すように、反応色が黄色から黄褐色および赤褐色の懸濁液に変化したときに、myco合成されたMnO NPが肉眼で最初に検出されました。表面プラズマ振動の励起によるもの26。さらに、UV-Vis吸収強度ピークは350 nmでの最大吸光度で増加しており、図2Aに示すようにMnO NPの菌合成が確認されています。したがって、反応色と UV-Vis スペクトルは、十分に還元/安定化された MnO NP の菌合成が正常に完了したことを示しています。 UV-Vis 分光法は、幅広い吸収ピークを検出することによって生成されたナノ粒子の光学特性を調べるために最も広く使用されている技術です 18,27。以前の報告によると、MnO NP の紫外可視吸収スペクトルは、n → π⃰ および π → π⃰ 遷移により 284 ～ 400 nm の範囲でした 11,24,25。同様に、MnO NP の異なる吸収ピークは、合成方法に従って製造されたナノ粒子の形状とサイズの変化の違いを示しました 1,10。

(A) 真菌で作製した MnO NP の UV-Vis スペクトルは、350 nm で表面プラズモン共鳴ピークを示しました。(B) 最終的に作製した MnO NP、(C) 内生菌トリコデルマビレンス EG92 株の抽出物、(D) SEM 画像真菌で作製した MnO NP は棒状の構造を示します。

以前は、合成されたナノ粒子のさまざまな形状やサイズは還元剤/キャッピング剤に依存していました6,25。そこで、SEM を使用して、myco 合成した MnO NP の形態学的特徴を分析しました。作製した MnO NP の形態学的特徴は SEM 調査によって検出されました (図 2D)。これは、生合成反応中に発生した凝集を示しています。 SEM 画像は、棒状の形態で非常に明確に形成された MnO NP を示しています。さらに、その元素組成はEDX分析によって決定され、生理活性代謝物（キャッピング有機物質）に由来する可能性のあるOのシグナルとともにMnの強力ないくつかのシグナルが示されました（図3A）。また、EDX プロファイルは、myco 合成 MnO NP が Mn (64.45%) と O (35.5%) で構成される高純度の含有量であることを示しています。

EDX 分析 (A)、TGA 熱プロファイル (B)、および XRD 分析 (C) による、内生菌トリコデルマビレンス EG92 株抽出物を使用した真菌加工 MnO NP の特性評価。

図 3B は、最大 800 °C までのさまざまな温度でテストした、myco 合成 MnO NP の TGA 熱プロファイルを示しています。得られた TGA 曲線の傾きは、815 °C で観察された約 5.5% という小さな重量損失を示しています。これは、myco 合成 MnO NP の表面を取り囲んでいた水、未反応およびコーティングされた生理活性代謝物の放出によるものと考えられます。また、内生菌トリコデルマビレンス EG92 株を用いて菌合成された MnO NP の XRD パターンは、体心正方晶系 α-MnO の標準パターン (JCPDS ファイル No.44-0141) に完全に近づき、MnO NP の生成が確認されました。成功裏に達成されました（図 3C）。鋭い回折ピークが 2θ 18.56°、28.90°、37.34°、および 63.74°で検出され、それぞれ (200)、(310)、(211)、および (512) ファセットに割り当てられました。 XRD パターンにより、myco 合成 MnO NP の平均結晶子サイズは、Scherrer の式を使用して 35 nm と計算されます。

すべての内部寄生虫は、捕食者やストレス条件から宿主を守るために、さまざまな二次代謝産物 (フラボノイド、テルペノイド、糖、ケトン、アルデヒド、カルボン酸など) を生成しました 25,28。これらの生理活性代謝物は、ナノ粒子の減少に関与している可能性があります 18,29。そこで、試験済みの内部寄生菌トリコデルマビレンス EG92 株から抽出された植物化学物質を分析しました。 FTIR分光法を使用して、MnO NPの製造反応に還元キャップおよび安定化剤として関与する真菌抽出物中の生物活性代謝産物を同定しました。図４Ａに示すように。生体分子が、myco 合成された MnO NP のキャッピング/安定化に関与している可能性があるため。特に無機物質および有機物質の含有量が低く、FTIR 分析によって検出されます。 ν 3921 cm−1 (O-H 伸縮振動)、ν 2117 cm−1 (C-C 伸縮振動)、ν 1639 cm−1 (C = 伸縮振動)、ν 1107 cm−1 に鋭い吸収ピークが観察されました。（CH3変形振動）、ν 1064 cm−1（アミン基）、ν 962 cm−1（芳香族基）、ν 759 cm−1（CH2変形振動）、ν 644 cm−1（-OH基）、 ν 437 cm−1 (C-C スケルトン振動)。これらは、異なる官能基が myco 合成 MnO NP に関与している可能性があることを示しています。

内生菌トリコデルマビレンス EG92 株の抽出物の FTIR スペクトル (A)、および真菌で作製した MnO NP (B)。

図4Bでは、O-H、O-H-O、CH3基の振動に割り当てられたν1325、1209、1107cm-1などのさまざまなFTIRバンドが生合成スペクトルに消失しました。また、ν 1410 cm−1 にバンドが現れており、C-H 変形振動の存在を示しています。したがって、FTIR スペクトルにおけるこれらの変化は、MnO NP の生合成を完了するために使用される活性基として認識される可能性があります。一方、myco合成MnO NPのメタ酸素Mn-O-Mn屈曲振動は、ν 615および516 cm-1で記録されたν 750 cm-1未満のバンドでも確認されました。観察されたピークや観察によると、真菌抽出物や菌類が合成した MnO NP 中のフェノール、アルカロイド、炭水化物、アミノ酸、タンパク質生体分子の存在は、Mn イオンの MnO NP への変換を助け、それらをさまざまな生体分子のシールドで覆う可能性があります。植物化学分析の結果。

真菌細胞は通常、有毒物質を無毒物質に変換する重要な代謝産物を生成します。いくつかの生理活性分子がこの方法で重要な役割を果たすため、これらの代謝産物はナノ粒子の生物製造に関与している可能性があります30、31、32。一般に、真菌細胞は、細胞外および細胞内でナノ粒子を合成するために使用され、特にタンパク質や植物化学物質ポリペプチドなどの多くの生理活性代謝産物を分泌する内生菌は、菌糸外の酵素などを細胞内に捕捉する33。他の微生物と比較して、内生菌は金属塩に対する耐性と結合能力が優れています。したがって、これらの真菌細胞は、効率的で低コストの下流プロセスを含むナノ粒子の大規模生産に有利です。さらに、さらなる報告により、内生菌の速度論が遅いため、生成されるナノ粒子の形状とサイズは、特に細胞外で生成される場合、長期間安定であることが明らかになりました 31。ここで、内生菌トリコデルマビレンス EG92 株を介した MnO NP の生合成反応は、還元剤/キャッピング剤および安定化剤として使用される生成された生理活性代謝物に依存していました。図 5 に示すように、生物活性代謝産物の生産を最大化するために、さまざまな工業用真菌培地を使用して内生菌トリコデルマビレンス EG92 株の培養を研究しました。

MnO NP を作製するための内生菌トリコデルマウイルス株 EG92 の培養用に選択したさまざまな培地。 Czapek-Dox培地（CDM）、イーストモルト培地（YMM）、合成培地（SM）、グルコース大豆粕培地（GSM）、イーストグルコース培地（YGM）、および小麦ふすま培地（WBM）。

内生菌トリコデルマビレンス EG92 株は、テストしたすべての培地 (CDM、YMM、SM、GSM、YGM、および WBM) を使用して良好に増殖しました。しかし、優れた培地は、最高の細胞質量重量 (6.91 g/l) と MnO NP 収量 (9.53 g/l) を生成する WBM であり、さらなる研究のために選択されました。続いて、生成された生理活性代謝産物を真菌の細胞質画分と細胞外画分に区別して、MnO NP の質量重量を最大化するために使用される優れた細胞コンパートメントを検出しました（表 2）。

WBM を使用して培養された内部寄生菌株 EG92 は、アルカロイドとフェノール、および少量の総炭水化物 (14.69 mg/μl) と総タンパク質 (12.65 mg/μl) を、MnO NP (2.03 g/l) の製造に使用される細胞質画分に生成しました。。一方、試験した細胞外画分には、アルカロイド、タンニン、フェノール、ステロイド、テルペノイドなどのさまざまな生理活性代謝物が含まれており、総炭水化物 (21.65 μg/ml) と総タンパク質 (16.3 mg/μl) の量も含まれており、9.53 g/l が生成されました。 MnO NPの。最後に、細胞外画分にさまざまな生理活性代謝産物を生成する内生菌株 EG92 を培養するために WBM が選択され、MnO NP の収量が 9.53 g/l に最大化されました。小麦ふすま抽出物を使用したトリコデルマ株の培養は、以前の報告によって強く裏付けられていました 34,35。農業廃棄物から抽出された有機物は一般に、微生物細胞、特に真菌細胞を培養するための無害でコスト効率の高い豊富な栄養素源として使用されてきました。小麦ふすま抽出物には、利用可能なタンパク質、アミノ酸、元素、炭水化物が豊富に含まれているため、トリコデルマ属の低コスト培養に適した増殖培地として以前に報告されています。固体発酵を使用する。ただし、浸漬発酵システムではまれにしか使用されていません36。

これまで、最適化戦略には、一度に 1 つの変数 (OVAT) や統計的実験計画法 (DOE) などのいくつかのアプローチが適用されてきました 19、25、37。 OVAT 戦略は、すべての変数がこれらの変数間の相互作用を無視して個別に研究されるため、非効率的で時間のかかる方法であると考えられています。しかし、DOE アプローチはこれらの問題を克服し、試行回数と実験誤差を減らすことができます。研究者のほとんどは、テストされた変数を最適化するために、Plackett-Burman 計画、次に Box-Behnken 計画を広く使用していました。私たちの試みでは、OVAT 法を使用してすべての精巣変数の動作範囲を縮小し、その後 DOE を適用しました。図6に示すように、内部寄生菌株EG92のバイオマスとMnO NPの収量を最大化するために、小麦ふすま粉末を使用して抽出された可溶性栄養素の量に影響を与える要因が研究されました。最適化された小麦ふすま重量は 50 g/l であったため、図 6A に示すように、生成された真菌細胞質量重量 (10.06 g/l) および MnO NP (13.4 g/l) に影響を与えました。

内生菌トリコデルマビレンス EG92 株バイオマス生産に影響を与える小麦ふすま粉末からの可溶性栄養素の抽出とその後の MnO NP の作製の効果的な条件。

さらに、抽出プロセスの 24 時間後に、最大真菌細胞質量重量 (10.5 g/l) および MnO NP (14.3 g/l) が記録されました (図 6B)。同時に、抽出溶液のpHを6、7、8などの異なる値に調整し（図6C）、真菌に使用される小麦ふすま粉末から抽出された可溶性栄養素を最大化するための適切なpHを区別しました。栽培。この場合、最大真菌細胞質量重量 (10.3 g/l) と MnO NP (13.3 g/l) は pH 6 で検出されました。また、WB 抽出に使用される最適温度は 50 °C と決定され、図6Dに示すように、最大真菌細胞質量重量（11.5 g/l）およびMnO NP（14.9 g/l）。その後、小麦ふすま 50 g を蒸留水 1 l と混合し、pH 6 に調整し、50 °C で 24 時間加熱することにより、小麦ふすまから可溶性栄養素を抽出するのに十分な条件を最終的に準備しました。この条件では、最大真菌細胞質量重量と MnO NP はそれぞれ約 15.3 g/l と 22.35 g/l と記録されました。これは基礎条件（BC）よりも 2 倍増加しました。

発酵設定の最適化は、バイオ精製所の経済性を向上させるための重要な制限です。応答曲面法 (RSM) は、いくつかの変数の最適化とモデル化に適用される統計的アプローチです。これは、実験計画と第 1 または第 2 の多項式を使用した補間を統合することにより、最適なプロセス条件を決定するために使用されました 38、39、40。この研究では、統計的に重要な変数を検出することによって内生菌株 EG92 の培養条件を改善するために、Plackett-Burman の設計が初めて採用されました。表 3 は、20.3 から 41.30 g/l までの乾燥細胞質量の変化をまとめており、最高のバイオマス生産性を最適化するための培養条件を調査することの重要性を反映しています。モデルの決定係数 (R2) は、応答変動の 97.73% がこのモデルで説明できる一方、全体の変動の 2.27% は説明できないことを示しています。

さらに、計算された F 比は回帰モデルの理論的な値よりも高く、その重要性が示されました (表 4)。計算された主効果は、図７Ａに示すようなグラフとしてグラフ化された。撹拌、pH、および CuSO4 を除くすべての変数は乾燥細胞質量重量にプラスの影響を与えるため、マイナスの影響もあります。また、この円グラフでは、F3 (14%)、F8 (22%)、F6 (45%) など、さまざまな重要な変数の存在寄与が最も高くなります。したがって、これらの因子は、内生菌株 EG92 の最終乾燥細胞質量生産量を増加させるための重要な変数と考えられます (図 7B)。

プラケット・バーマン設計に従った、エントファイト性トリコデルマ・ビレンスEG92株の乾燥細胞量に対する試験変数の影響を示す統計分析。 (A) テストされた変数の計算された主効果の縦棒グラフ、(B) 各変数のパーセント分布の円グラフ、(C) 計算された p 値と信頼水準を表すパレート図。

さらに、グラフ化されたパレート図は、信頼水準 (%) と p 値を使用して各推定変数のランキングを示します (図 7C)。接種材料の年齢 (98.11%)、pH (99.4%)、接種材料のサイズ (99.96%) など、有意な変数の信頼レベルは最大 95% であるため、非有意変数と有意変数は計算された信頼レベル (%) によって単純に検出されました。、WBE (99.79%)。最後に、この改善は、接種材料の年齢 (48 時間)、撹拌 (150 RPM)、pH 6、CuSO4 (0.01 g/l)、インキュベーション温度 (30 °C)、WBE (30%)、グルコース (10 g/l) で達成されました。 l)、接種材料のサイズ (4%)、および MgSO4 (0.1 g/l)。これらの条件では、内生菌株 EG92 の最大乾燥細胞質量が、BC を使用した場合よりも最大 6 倍 (42.68 g/l) 増加しました。続いて、真菌の生理活性代謝産物を使用して、最大 5 倍 (55.29 g/l) に増加する MnO NP を製造しました。

次に、選択した 3 つの独立した因子 (pH、WBE、および接種材料のサイズ) をボックス・ベンケン設計によって統計的に最適化し、最大の真菌バイオマス重量を生成しました。最も重要な変数のレベルは低 (-)、中間 (0)、および高 (+) の値で変化する一方、有意でない変数はその値で安定しました。表 5 は、実験値と予測乾燥細胞質量重量に加えて、コード化値と実際の値の両方を示す、テストされた変数の計画行列を表します。乾燥細胞質量重量に影響を与える重要な変数の最適化は、応答変数を独立変数のコード化レベルに関連付けて生成された回帰式によって達成されました (表 *8)。これらの結果は、3 つの独立変数が乾燥細胞質量の量を大幅に増加させることを示しています。したがって、乾燥細胞質量には 58.18 g/l (トレイル 2) から 86.89 g/l (トレイル 13) までのばらつきがあります。 F 値が表に示された値よりも数倍高かったため、このモデルは高い信頼レベルで有意です。確率の p 値も非常に低かった (p ≤ 0.05)。モデルの決定係数 (R2) は、このモデルが指定できる応答変動性の 96.47% を示しています。同時に、総変動量の 3.53% は定義できません (表 6)。高い相関 (調整 R2 = 0.90) も、モデルの重要性が高いことを裏付ける精度の程度を示しました。

さらに、パレート図 (図 8A) は信頼水準 (%) を使用してグラフ化され、p 値は各変数の順位を示しました。重要な変数の信頼水準は最大 95% であるためです。 ANOVA により、各変数の寄与率とテストされた変数間の交互作用が決定されました。図 8B は、さまざまな変数の存在寄与が最も高く、X22 (40%) で記録され、X32 (23%)、X12 (8%) が続きます。さらに、重要な変数の相互作用効果に寄与する最も高い存在は、X2X3 (16%) と X1X2 (6%) の間で記録されました。したがって、これらの変数およびそれらの混合物は、内生菌株 EG92 の産生乾燥細胞質量重量を改善するために重要です。二次多項式モデルは式 1 によって当てはめられました。 (4) を使用し、実際の値は式 (4) を使用して計算されました。（５）最適点を予測する。結論として、この改善は、pH 5.5、WBE (35%)、および接種材料サイズ (10%) で達成され、内生菌株 EG92 の最大乾燥細胞質量が BC を使用した場合の最大 12 倍 (89.63 g/l) に増加しました。。続いて、真菌の生理活性代謝産物を使用して、最大 8 倍 (82.93 g/l) に増加した MnO NP を製造しました。

ボックス・ベンケン実験計画に従った、エントファイト性トリコデルマビレンス EG92 株の乾燥細胞質量に対する試験済みの重要な変数の影響の統計分析。 (A) パレート図は計算された p 値と信頼水準 (%) を表し、(B) 円グラフは各変数のパーセント分布を示します。

この研究では、液中発酵システムを使用して、7 L バイオリアクター内でのバッチ発酵モードによる内生菌株 EG92 の増殖動態を研究しました。液中発酵システムは、制御が向上する単純化されたプロセスであると考えられていたためです。一方、糸状菌の生産のスケールアップは、撹拌速度や空気流量などの多くのパラメーターの影響を受けました。したがって、内部寄生菌株を最大化するには、EG92 乾燥細胞質量重量で最高の MnO NP 収率が得られます。バッチ発酵 (BF) モードでの 7 つの制御戦略を介して、さまざまな通気/撹拌速度とタイミングの混合特性を研究しました (図 9)。反応速度論の結果は、Xmax と Pmax の変動を示し、異なる通気/撹拌速度とタイミングに応じて最も高い生理活性を示しました。図9に示すように、B6のケースで使用した曝気/撹拌方式(DOレベルが40%を下回らないように調整された空気流と撹拌)は、最高のXmax (145.63 g/l)およびPmax (99.52 g/l)を生成しました。 162 時間後のμmax および YX/S は、それぞれ 0.084 および 7.65 と記録されました。したがって、DO レベルを 10% 以上に調整することは、内生菌株 EG92 の増殖に影響を与える重要な要素であると考えられ、BC よりも最大 21.08% (145.63 g/l) 増加します。続いて、これらの濃度の生理活性代謝物を使用して作製された MnO NP は、基本的な還元/キャッピング剤の濃度よりも最大 10 倍 (99.52 g/l) 増加しました。バッチ発酵モードの終了時点で、テストされた 4 つの供給戦略が異なる流加バッチ発酵モードによって開始されました。これらのテストされた 4 つの流加発酵モード (FBF) は、真菌増殖の生産をスケールアップすることのみを目的として、最適化された培地成分または WBE によって設定されました。図10に示すように、内生菌株EG92細胞と生成されたMnO NPの挙動を説明するために、異なる給餌戦略が利用されました。最高のデータは、指数関数的パルス給餌体制 (FB4) を介して WBE を給餌することによって記録されました。それ以来、μmax (0.082) および YX/S (20.69) で 48 時間後に Xmax および Pmax はそれぞれ 295.36 および 217.95 g/l として記録されました。これらの結果は、内部寄生性トリコデルマバイオマス生産を最大化し、それによって廃棄物を使用したMnO NP生合成を最大化するという点でユニークであると考えられており、これは私たちの知る限りこれまでに行われたことがありません。

内部寄生菌T.virens EG92株の増殖に対する異なる通気および撹拌レジームとそのタイミングの影響、したがって7 Lバイオリアクター内でバッチモードによる浸漬発酵システムを使用して製造されたMnO NPの質量重量。 (B1); 気流は 1 ～ 4.5 vvm/12 時間で開始し、撹拌は 100 ～ 800 rpm/6 時間で開始します。(B2) 気流は 0.5 ～ 2 vvm/6 時間で開始し、撹拌は 100 ～ 800 rpm/3 時間で開始します。(B3) 気流は1.5 ～ 3.5 vvm/12 時間で開始し、撹拌は 50 ～ 250 rpm/6 時間で開始。(B4) 気流は 0.5 ～ 2.5 vvm/6 時間で開始し、撹拌は 400 rpm で一定、(B5) 気流は 2 vvm/で一定12 時間、撹拌を 50 ～ 300 rpm/6 時間で開始、(B6) 溶存 O2 レベルが 10% を下回らないように空気流と撹拌を調整、(B7) 溶存 O2 レベルが下回らないように空気流と撹拌を調整40％。

内生菌 T. ビレンス EG92 株の増殖に対するさまざまな流加発酵モードの影響を研究し、7 L バイオリアクター内で流加モードによる浸漬発酵システムを使用して製造された MnO NP の質量重量を研究します。 (FB1) 培地全体の一定供給、(FB2) 培地全体の指数関数的パルス供給、(FB3) WBE の一定供給、(FB4) WBE の指数関数的パルス供給。

最良かつ最も安定した結果を生み出すための理想的な実験条件を見つけるために、ナノマテリアルの生合成中に最適化技術が採用されます。従来の最適化システムは独立変数間の相互作用を無視しており、多くの実験を実行すると時間とコストがかかります。私たちの研究では、バイオマス生産とMnO NPの収量に対するさまざまなパラメーターの影響を、直交配列と分散分析を使用して最適な条件を見つけるための統計的実験計画法（タグチ法）によって測定できました。タグチの実験計画はロバストパラメーター計画としても知られており、さまざまな実験条件を比較し、変動が最も少ない条件を最も強力なものとして選択できます。

したがって、タグチ設計法は、生産性を最大化するためのシンプルで効率的かつ体系的な結果を提供する統計的最適化ツールです26,41。還元/キャッピング剤として真菌抽出物を使用し、親化合物 (前駆体) として MnCl2・4H2O を使用して MnO NP の生成を最適化する最も影響力のある変数を研究するために、5 つの因子で 6 つの因子を使用する 25 のトレイルでタグチ実験計画 (TD) が計画されました。レベル。次に、菌類で作製した MnO NP の質量重量 (モデル応答) を決定して、各試行の最大の S/N 比を計算しました (図 11G)。一般に、MnO NP の質量重量の増加には、160.45 ± 1.99 g/l (トレイル 5) から 315.3 ± 0.19 g/l (トレイル 19) までのばらつきがあるため、テストされた変数により、(表7）。

金属前駆体濃度を含む、示された重要な要因の影響の統計的評価。 (V1)、還元剤/キャッピング剤濃度。 (V2)、温度(V3)、pH(V4)、安定剤濃度(V4) MnO NP の生物起源の生成に関する (V5) および反応時間 (V6) は、Taguchi 実験計画を使用して実行されました。 (A) 真菌で製造した MnO NP の S/N 比の応答グラフ、(B) 各因子のパーセント分布を示す円グラフ。

回帰式は、応答 (従属変数) と独立変数のコード化レベルによって生成されました (表 8)。モデルの決定係数 R2 = 0.9814 は、このモデルの応答変動の 98.14% を指定できる一方、全体の変動の 1.68% は定義できないことを示しています。高い相関 (調整 R2 = 0.9751) は、モデルの重要性が高いことを裏付ける精度の程度も示しています。 F値が表よりも数倍高かったため、モデルは有意でした。さらに、有意な変数の信頼水準は最大 95% であるため、計算された信頼水準 (%) と p 値は各変数のランクを示しました。図１１Ｈは、様々な変数に対する最も高い存在寄与が反応時間（６６％）で記録され、続いて反応温度（１７％）および反応ｐＨ（９％）を示している。したがって、これらの変数とその混合物は、内生菌 T. ビレンス EG92 株抽出物を使用して MnO NP の質量を増加させるために重要であると考えられます。最後に、親化合物として MnCl2・4H2O (0.25 M)、還元/キャッピング剤として真菌抽出物 (100%)、反応 pH ~ 5、反応温度 (60 °C) で、真菌で作製した MnO NP 反応の改善が達成されました。 )、反応時間 (5 時間)、安定化剤としての真菌抽出物 (20%)。したがって、真菌によって製造された MnO NP の最大質量重量は、BC の 40 倍 (395.36 g/l) まで増加しました。最後に、この研究は、統計的バイオプロセシング戦略を通じて内部寄生性トリコデルマウイルスを使用し、抽出された生理活性代謝産物を使用して MnO NP を工業的に製造した最初の研究と考えられています。また、作製した MnO NP は、キャッピング/還元剤として内生菌株 EG92 の細胞外生物活性代謝産物を、親化合物として MnCl2・4H2O を使用して生物学的に調製されました。

図 12 は、内生菌株 EG92 質量重量および真菌製造 MnO NP 質量重量の生産をスケールアップするために適用された統計的バイオプロセシング戦略を示しています。これらの実験は、PB および BB 設計を使用して内生菌株 EG92 の培養条件を最適化するように設計されました。これらの細胞、したがって MnO NP は、BF および FBF モードの浸漬発酵システムを利用する半工業用バイオリアクターでスケールアップされました。 BF 培養システムは複数の通気/撹拌速度を使用して強化されたため、指数モードまたはパルスモードを使用した培地全体または WBE に対するさまざまなフィード戦略を使用して、FBF モードも改善されました。さらに、MnO NP の製造反応も TD によって最適化されました。一般に、これらの統計的戦略には、従来の方法に比べて重要な利点があります。最終結果は、図12に示すように、乾燥細胞量と真菌で製造されたMnO NPの生産が増加したことを示しました。

Plackett-Burman (PB)、Box-Behnken を使用して、内生菌トリコデルマビレンス EG92 株の質量重量 (g/l) および真菌で製造された MnO NP の質量重量 (g/l) を最適化するために適用されたバイオプロセシング戦略の概要(BB)、田口 (TD) の実験計画。最終的に基礎条件 (BC) と比較した、バッチ (BF) 流加バッチ (FBF) 発酵モードによる浸漬発酵システムによる半工業用バイオリアクター (7 L) による真菌大量生産のスケールアップ生産。

現在まで、内生菌トリコデルマビレンス抽出物を還元剤、キャッピング剤、安定化剤として使用し、その後、さまざまな統計実験手法を使用して操作変数を工業的に最適化し、その後フェドバッチによる生産をスケールアップすることによる MnO NP の生合成を検討した研究はありません。発酵。

異なる濃度の作製した MnO NP を調製して、その拮抗活性を評価し、さまざまな植物病原体を使用して MIC、MBC、および MFC を検出しました。表 9 は、阻害ゾーンの直径をミリメートルで示しています。全体として、マイコ合成 MnO NP の優れた MIC は、植物病原性細菌に対して 210 μg/ml で記録されましたが、植物病原性真菌に対しては 330 μg/ml で検証されました。植物病原性真菌の場合、最大の阻害ゾーンは Alternaria alternat (42.75 ± 3.96) に対して記録され、続いて Helminthosporium sp. (40.38 ± 2.58) が記録されましたが、最も低い阻害ゾーンは Phytophthora arearia に対して測定されました (28.13 ± 2.97) でした。しかし、植物病原性細菌に対しては、エルウィニア・アミロヴォラ（50.62±2.34）に対して最大の阻害ゾーンが記録され、次いでアセトバクター・パストゥリアヌス（47.81±6.34）、エルウィニア・カロトヴォラ（42.18±2.56）が続いた。最も低い結果は、Clavibacter michiganensis (33.75 ± 1.90)、Erwinia persicina (39.37 ± 1.02) に対して認められました。また、得られた MBC 値は 200 ～ 280 μg/ml の範囲であり、MFC 値は 340 ～ 440 μg/ml まで広がりました。一般に、この研究では、マイコ合成された MnO NP は、真菌よりも植物病原性細菌に対して迅速かつ効果的な拮抗活性を示します。当社のマイコ合成MnO NPは、真菌よりも植物病原性細菌に対してより迅速かつ正確な拮抗活性を有するため、将来的には、さまざまな病気の病原体を制御するための代替ナノバイオ農薬として使用される可能性があります。 MnO NP には、細胞膜の歪みや破壊を誘導することで病原体細胞に迅速に侵入し、微生物の細胞死を引き起こす能力など、いくつかのユニークな特性があります。ジョシら。は、植物抽出物（還元剤としてチョウセンアサガオの葉抽出物）を使用して MnO2 NP を生合成し、その後 10 mg/ml の MnONP をヒトの病原体に対して検査したところ、それらが効果的な拮抗効果（30 ～ 44 mm）を示すことを発見しました24。 ZnO、MnO2、および MgO NP を生合成するために、Ogunyemi らは根圏細菌 (パエニバチルスポリミクサ株 Sx3) を使用しました。彼らの研究では、植物病原性細菌 (Xanthomonas oryzaepv.oryzae) に対する 16.0 μg/ml の濃度での顕著な阻害効果 (13 ～ 17 mm) が明らかになりました 6。この研究によると、イネへの適用は植物の成長因子とバイオマスを強化すると同時に、イネの細菌性葉枯病の発現を低下させるという。したがって、これらの金属ナノ粒子は毒性がなく、生体に安全で、低用量では生体適合性があります。最後に、農業における潜在的な農薬としての菌合成 MnO NP の野外応用は、これまで徹底的に調査されていませんでした。

この研究では、MnCl2・4H2O (前駆体) と、培養した内生菌トリコデルマビレンス EG92 株抽出物 (還元剤、安定化剤、キャッピング剤) を利用して、平均結晶子サイズ約 35 nm の棒状のマイコ合成 MnO NP を生物学的に合成しました。小麦ふすま培地で。複数の統計的最適化アプローチ (Placket-Burman 計画および Box-Behnken 計画) を使用して、最高の真菌細胞質量重量を達成しました。プラケット・バーマン計画は、真菌バイオマス生産に対する主要な影響をスクリーニングするために使用されて以来。次に、ボックス・ベンケン要因計画を使用して、重要なパラメーターと生成された真菌バイオマス重量の間の相関関係を相関させました。次に、調整可能な通気/撹拌速度を備えた浸漬発酵バッチモードと、それに続く指数関数的パルス供給システムを使用する流加発酵モードを使用して、EG92 細胞と MnO NP の収量を工業的に向上させました。 48 時間後、この工業生産ラインは Xmax (295.36 g/l) および Pmax (217.95 g/l) を生成しました。タグチ設計を使用して製造反応を改善すると、MnO NP の収量はベースライン条件より 40 倍 (395.36 g/l) 増加しました。これらの結果は、内部寄生性のトリコデルマバイオマス生産を最大化し、その結果、廃棄物を使用したこれまでに行われたことのないMnO NPの生合成を最大化するという点でユニークです。このレベルの乾燥重量バイオマスと MnO NP の生産性は、これまでに見たことがありません。植物病原体に対する拮抗活性を調査したところ、Erwinia amylovora (50.62 ± 2.34) が最も高い阻害ゾーンを有し、次に Alternaria alternat (42.75 ± 3.96) が続きました。さらに、細菌細胞の MBC 値は 200 ～ 280 μg/ml の範囲であったのに対し、植物病原性真菌細胞の MFC 値は 340 ～ 440 μg/ml の範囲でした。最後に、これらの myco 合成 MnO NP は、低用量で非毒性、生物学的に安全で、生体適合性があります。その結果、農業におけるナノバイオ農薬として利用できる可能性がある。

健康なエジプト黒ナス (Solanum melongena L.) の葉は、エジプト、アレクサンドリアのニューボルグエルアラブ市にある科学研究技術応用都市 (SRTA シティ) の実験農場から収集されました。試験した植物病原性真菌（フザリウム・ソラニ、フザリウム・モニリフォルメ、ヘルミンソスポリウム属、アルテルナリア・オルタナティブ、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・ニガー、およびフィトフトラ・アレナリア）および細菌（クラビバクター・ミシガネンシス、エルウィニア・カロトボーラ、アセトバクター・パストゥリアヌス、エルウィニア・アミロヴォラ、およびエルウィニア・ペルシシナ）を収集した。エジプトSRTA市GEBRIバイオプロセス開発学部およびエジプトエルシャルキアのザガジグ大学農学部出身。

植物の葉を水道水で 3 回洗浄し、70% エタノールに 5 分間、99% エタノールに 2 分間順次浸漬し、最後に葉を (10% NaHCO3: 0.1% Tween) からなる 6% 滅菌溶液に浸漬しました。 -20) 2分間。滅菌した葉を滅菌蒸留水で数回洗浄し、層流キャビネット内で乾燥させました 33。最終すすぎ水を、２００ｇのジャガイモ、２０ｇのデキストロース、および２０ｇの寒天を含むポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）プレート上に広げ、滅菌ステップを試験した。これらの滅菌葉を滅菌メスの刃で切断して粉砕し、乳鉢で粉砕した。段階希釈法を使用して、100 μl の希釈葉抽出物を調製し、PDA プレート上に広げ、30 °C で 3 週間インキュベートしました。 PDA プレートを使用して、内部寄生菌を選択し、精製しました。最後に、精製した内部寄生菌を、0.3% 麦芽抽出物、1% グルコース、0.3% 酵母抽出物、0.5% ペプトンから構成される MGYP ブロス培地を使用して増殖させ、最終 pH を 5.9 に調整しました。次に、これらの培養物を振盪条件（150 rpm）下、30 °C で 72 時間インキュベートしました。

MnO NP は、MnCl2・4H2O を親化合物 (前駆体) として、真菌抽出物を還元剤、安定化剤、およびキャッピング剤として使用して生合成されました。 MnO NP は、100 ml の真菌抽出物を 100 ml の 1 M MnCl2・4H2O と混合し、続いて 60 °C で 2 時間継続的に撹拌することによって合成しました (インキュベーション 1)。 Mnイオンの還元により反応色が黄色から黄褐色に変化します。過剰量の真菌抽出物（50 ml）を生成したMnO NPに加え、撹拌条件（200 rpm）下、室温（28℃）で5時間インキュベートしました（インキュベーション2）。その後、キャッピング段階により反応色が黄褐色から赤褐色に変化します (これは肉眼で容易に認識できます)6,27。最後に、真菌が合成した MnO NP を 10,000 rpm で 20 分間遠心分離し、蒸留水とエタノールで 3 回洗浄しました。次に、茶色の残留物をオーブンで 50 °C で 24 時間乾燥させました。乳鉢と乳棒を使用して、MnO NP を推定微粉末 (g/l) に粉砕し、キャップ付きバイアルに保管しました。井戸拡散法により、植物病原性真菌および細菌は、生合成された MnO NP の抗植物病原性活性を推定しました。

真菌で作製した MnO NP の紫外可視吸収スペクトルは、島津紫外可視分光光度計 (島津製作所、東京、日本) で測定しました。真菌の細胞外画分および真菌で作製された MnO NP の FTIR スペクトル分析は、4000 ～ 400 cm-1 のスペクトル範囲で (島津 FTIR-8400 S、日本) で記録されました。 SEM: MnO NP の形態学的構造は、EDX 結合ユニットを備えた (JEOL JSM 6360LA、日本) を使用した走査型電子顕微鏡 (SEM) 調査によって検出されました。真菌で作製した MnO NP の熱安定性は、熱重量分析 (TGA) モデル (TGA/DSC、島津製作所、日本) を使用し、窒素流下で 20 °C/分の加熱速度で測定しました。 X 線回折パターン (XRD) は、(島津 7000 回折計、日本) を使用し、30 kV および 30 mA で生成された CuKα 放射線 (λ = 0.15406 nm) を使用し、スキャン速度 2°/min、20 の間の 2θ 値で操作して取得されました。そして80℃。平均結晶サイズは、式 1 に示すように Scherrer の公式を使用して推定されました。 (1); ここで、Y は菌類で作製した MnO NP の結晶サイズ、λ は CuKα 放射線の波長、β は異なるピークの半値幅、θ は半回折角です。

5 つの単離された内部寄生菌のうち、1 つの単離株は、優れた抗植物病原体活性を持つ真菌で作られた MnO NP を高頻度で産生するように見え、さらなる調査のために選択されました。リボソーム内部転写スペーサー (ITS) を決定するために、(Promega, USA) から入手した Minipreps DNA キットを使用して真菌ゲノムを抽出および精製しました。 ITS領域は、10pmolのITS1プライマー(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')および10pmolのITS4プライマー(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')を用いたPCRを使用して増幅した。この反応は、100 mg の真菌 DNA、2.5 mM の各 dNTP、および 1.5 mM MgCl2 を 0.4 μl の 500 U Taq DNA ポリメラーゼと混合することによってセットアップされました 42。初期変性温度は 95 °C で 5 分間まで延長され、最終延長は 72 °C で 10 分間まで延長されました。 PCR産物は電気泳動によって分離され、UVトランスイルミネーターを使用して観察されました。電気泳動による泳動に従って、シリカスピンカラム (DNA Clean & Concentrator、Zymo Research) を使用して、目的の PCR 産物をゲルから溶出しました。精製された PCR 産物は、製造業者 (日本、日立、Applied Biosystems のモデル 3130 自動 DNA シーケンサー、遺伝子分析装置) が推奨するプロトコールに従って直接配列決定されました。 http://www.ncbinlmnih.gov/ で利用可能な NCBI BLAST を使用して、配列を相同配列と比較しました。 BioEdit ソフトウェア (Hall、1999) を使用して多重配列アラインメントを実行し、MEGA6 プログラムによる近隣結合 (NJ) 法を使用して系統樹を構築しました。

抽出された生理活性代謝物は、MnO NP の製造における還元剤、キャッピング剤、安定化剤として使用されました。そこで、細胞外および細胞質画分を抽出して、最も高い量の MnO NP が生成された優れた真菌細胞コンパートメントを検出しました。最大の代謝産物を生成する菌類培養培地の比較評価戦略も研究されました。まず、使用した増殖培地は、（表 1S、補足資料）に示すように、他の場所で報告されているように選択されました43、44、45。試験したすべての培地 (50 ml) を 250 ml フラスコで調製し、別々に 121 °C で 15 分間オートクレーブ滅菌しました。小麦ふすま培地 (WBM) の場合、小麦ふすま抽出物 (WBE) は、オーブンで乾燥させた小麦ふすま 10 g を蒸留水 90 ml と 60 °C で 5 時間混合し、その後 100 °C で 1 分間インキュベートすることによって調製されました。 1時間。その後、抽出された栄養素は、調整可能な pH 7.046 の濾過システムによって分離されました。この濾液を蒸留水で総量 100 ml にし、別々に 121 °C で 15 分間オートクレーブ処理しました。すべての滅菌培地に真菌接種材料 (5%、v/v) を接種し、28 °C で 48 時間 (150 rpm) 培養しました。限外濾過システムで真菌バイオマスを収集し、細胞外画分を調製しました。収集した真菌バイオマスを 50 mM PBS (pH 7.0) に懸濁して細胞質画分を抽出し、40 ～ 50% の負荷で 25 ～ 30 バースト超音波処理しました。最後に、得られた画分を 10,000 rpm で 20 分間遠心分離し、清潔なガラスねじボトルに入れて 4 °C で保存しました。すべての画分の総タンパク質および炭水化物含量は、Commercial-Rad比色タンパク質アッセイキットおよび炭水化物比色アッセイキット(Milpitas, CA 95035 USA)を使用して測定した。植物化学分析（アルカロイド、フラボノイド、タンニン、フェノール、ステロイド、サポニン、テルペノイドの含有量）は、還元剤、キャッピング剤、安定化剤として機能する十分な細胞画分を決定するための比較研究で検出されました21。最後に、比較研究でその乾燥重量を使用するために、前述のように MnO NP 反応の製造を設定しました。

使用されるバイオプロセス戦略は、小麦ふすま粉末から可溶性栄養素を抽出するための効果的な条件を開発することから始まりました。抽出方法は小麦ふすまから抽出される炭水化物、タンパク質、アミノ酸、その他の微量元素の量に影響を与えるためです。したがって、小麦ふすま粉末 (50、100、および 150 g/l)、抽出時間 (3、12、および 24 時間)、pH (6、7、および 8)、抽出温度 (30、これらの実験では、50 °C、および 70 °C) が研究されました。第二に、バイオマス生産に影響を与える培地成分全体と菌類の増殖条件が最適化されました。したがって、最高の真菌細胞質量重量を生成するために、連続的な統計的最適化アプローチ (Plackett-Burman および Box-Behnken 計画) が適用されました。 Plackett-Burman デザインは、真菌バイオマス生産に影響を与える重要な要因をスクリーニングするために採用されて以来。続いて、Box-Behnken 要因計画を適用して、重要な要因と生産された真菌バイオマス重量の間の関係を相関させました。

この実験計画は、さまざまな培養変数の影響を調査することによって真菌バイオマス生産を最適化するために採用されました。この研究では、使用されたマトリックスは 12 の実験 (トレイル) と 9 つの独立変数 (接種材料の年齢、撹拌、pH、CuSO4、インキュベーション温度、WBE (%)、グルコース、接種材料のサイズ、および MgSO4) で構成され、それぞれの変数はローレベル（−）とハイレベル（＋）です。重要な変数を検出するためにすべての試験を 3 回実行し、真菌バイオマス生産 (応答) の平均値を計算しました。最終データは統計的に分析され、標準回帰分析を使用して p 値と信頼レベルが決定されました。続いて、一次多項式モデル方程式 (式 2) が F 検定によって適用されました。ここで、Y は応答、βo はモデルの切片、βi は変数推定値、Xi は変数です 37,47。さらに、各因子の影響は式(1)を使用して決定されました。 (3); ここで、E(x) は菌類バイオマス生産量、N はトレイルの数、M+ および M- はそれぞれのレベルでのこの因子の影響です。

3 レベル設計は、バイオマス生産量に対する重要な要素の相互作用を調べることによって微生物の発酵プロセスを最適化するために使用される強力な統計的手法です。選択した 3 つの独立したパラメーター (pH、WBE、および接種材料のサイズ) を 3 つのレベルでテストし、それぞれ低値、中値、高値を表す -、0、+ でコード化して、最大バイオマス生産の理想的な点を計算および推定しました。 Minitab 18.1 ソフトウェアを使用して、応答変数を 2 次多項式モデル (式 4) を介してフィッティングし、従属応答を独立変数に相関させました。多項式モデル方程式の適合の質は、R239,40 の係数によって表されました。各因子の実際の値は、Myers と Montgomery の式 (式 5) を使用して決定されました。ここで、Y は予測応答、βo は切片、βi は一次係数、βij は二次係数、βii は Xi と Xj の間の線形相互作用、Xj は回帰係数、XiXj は応答変数に影響を与える入力変数です。 Y37。

試験した真菌株をまずポテトデキストロース寒天プレートに接種し、静的条件下で 30 °C で 14 日間インキュベートしました。次に、胞子懸濁液を無菌条件下で滅菌食塩水(0.9%)により調製した。これらの真菌の胞子を血球計数器で計数し、接種ステップに適した胞子懸濁液を調製した。二次培養は、振盪ボトル（1000 ml）内の統計的に最適化された培地 500 ml に、新たに調製した真菌胞子懸濁液（3 × 104 胞子/ml）0.5 ml を接種して準備し、30 °C でインキュベートしました。最後に、4.5 L の滅菌培地を含む 7 L BioFlo 310 バイオリアクター (New Brunswick Scientific、米国ニュージャージー州エジソン) に接種し、温度と pH をそれぞれ 30 °C と 5.5 に制御しました。バッチ発酵モードでの 7 つの制御戦略による応答として菌類バイオマスと MnO NP 生成を使用して、通気/撹拌速度とタイミングの混合特性を研究しました。テストされた戦略は表 10 に記載されているように設計されました。発酵期間中、サンプルを採取してバイオマスと MnO NP の生成を計算しました。

発酵期間の終点は、溶存酸素 (DO) 濃度の増加によって検出され、炭素源の枯渇を示しています 48,49。したがって、この時点で、異なる流加発酵モードを使用して 4 つの供給戦略をテストしました。テストした 4 つの流加戦略は、表 11 に記載されているように、最適化された培地成分全体または WBE のみによって設定されました。空気流量と撹拌速度は、テストしたすべての流加発酵モードで DO レベルが 10% を下回らないように制御されました。対数期では、真菌の細胞量は時間とともに指数関数的に増加します。一方、真菌の増殖と生成された MnO NP の挙動は、異なる方程式を使用した異なる発酵モデルによって速度論的に記述および決定されました 30、32。収量係数は、消費された炭素源と生産されたバイオマスによって決定されました。そのため、バイオマス収量係数 (YX/S)、最大バイオマス (Xmax)、最大 MnO NP 収量 (Pmax)、最大比増殖速度 (μmax) などの多くのパラメーターが計算されました。

MnO NP の生合成反応は、前駆体濃度 (親金属)、真菌抽出物の濃度 (還元/キャッピング剤)、pH、インキュベーション温度、インキュベーション時間 (反応時間)、安定化剤 (真菌抽出物) などのさまざまな成分と反応条件によって影響を受けました。）。タグチ設計は、この最適化戦略の熟練した生物学的製造ステップを通じて MnO NP の生産を最大化するために適用されました。したがって、これらの実験では、この最適化戦略を実行するために L25 Taguchi 直交アレイ設計 (5**6) が選択され、MINITAB 18 ソフトウェアが使用され、式 1 が使用されました。 (6–9)、真菌で製造された MnO NP の質量重量が決定され、最大信号対雑音比 (S/N) が各製造反応について計算されました 41。最後に、田口氏の結果に基づいて検証実験を実施し、予測S/N比を算出した。

真菌で製造された MnO NP の最小発育阻止濃度 (MIC) を記録し、計算しました。また、植物病原体 (細菌および真菌) に対する真菌で作製した MnO NP の拮抗活性が観察され、十分な拡散法によって決定されました 23。植物病原性真菌は Czapek 培地で培養したため、次の内容 (g/l): NaNO3、3.0; K2HPO4、1.0; MgSO4・7H2O、0.5; KCl、0.5; FeSO4・7H2O、0.01; および寒天、15 (pH 4.8)。さらに、植物病原性細菌を、(g/l): [ペプトン 5、塩化ナトリウム 5、牛肉エキス 1.5、酵母エキス 1.5、および寒天 15 (pH 7.0)] から構成される寒天培地に接種しました。異なる濃度の真菌で作製した MnO NP (10、50、90、130、170、210、250、290、330 および 370 μg/ml) を調製し、ウェル (0.5 mm) にロードしました。次に、これらのプレートを 30 °C で 24 ～ 72 時間インキュベートし、阻害ゾーンを調べました。最後に、最大殺菌濃度 (MBC) と最大殺菌濃度 (MFC) がチェックされ、決定されました50。これらの実験は三重に行われ、これらのデータは Minitab ソフトウェアを使用して一元配置分散分析によって統計的に分析されました。

この記事には、研究結果を裏付けるために使用されたデータが含まれています。著者らは、地域および機関のガイドラインに従って植物材料の研究を行うためにさらなる承認は必要なかったと明言しています。この分離株は、トリコデルマビレンスと完全に類似していたため、受託番号 MF429775 で内部寄生性トリコデルマビレンス株 EG92 として GenBank データベース (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MF429775) に登録されました。

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IS ヤヒア & HY ザーラン

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SHEは、研究のアイデアとコンセプトを提案し、研究計画を立案し、大部分の実験を実行し、データを収集し、分析し、原文を執筆/編集し、原稿をレビューしました。 ISY: データ分析とコンサルティング。 HYZ: データ分析、コンサルティング、最終原稿の見直し。 EAK: データ分析、データの解釈、および元の原稿と最終原稿の執筆/編集。最終原稿は著者全員によって執筆、レビューされ、承認されました。

Shahira H. EL-Moslamy または Elbadawy A. Kamoun への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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EL-Moslamy、SH、Yahia、IS、Zahran、HY 他マイコエンドファイトを使用した MnO NP の新規生合成: 抗植物病原体薬剤としての評価による工業的バイオプロセス戦略と生産のスケールアップ。 Sci Rep 13、2052 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-28749-z

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受信日: 2022 年 5 月 16 日

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公開日: 2023 年 2 月 4 日

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