グラム治療用のウェアラブル補助オゾンおよび抗生物質治療システム | 北京アジャイルリフトベンチャーズグループ株式会社

Scientific Reports volume 12、記事番号: 13927 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

皮膚および軟部組織の感染症の有病率の上昇と、生命を脅かす抗生物質耐性感染症の増加という問題のある組み合わせにより、医療業界にとっては満たされていない緊急のニーズが生じています。これらの進化的耐性は、抗生物質の効果的な拡散を妨げる細菌の細胞壁の突然変異に起因します。グラム陰性菌は、細胞壁の独特な二重層構造により、多くの一般的な抗生物質に対して自然に耐性があるため、特別な考慮が必要です。今回開発されたシステムは、薬剤溶出性ナノファイバー（NF）を使用した新しい包帯を通じて、局所抗生物質の補助療法としてガス状オゾンを送達および利用するウェアラブル療法を通じて、この問題に対する 1 つの解決策を提供します。この技術は、酸化オゾンを使用して細菌の細胞壁によって生成される耐性を回避することにより、一般的な抗生物質に対するグラム陰性細菌の感受性を大幅に高めます。補助療法の簡単かつ効果的な適用を可能にするために、オゾン送達と局所抗生物質が単一の適用パッチに統合されています。薬物送達 NF は、ドレッシング材のガス透過性の低下を引き起こすことなく、速溶解 PVA マット内でのエレクトロスピニングによって生成されます。体系的な研究では、4 mg/h でのオゾン生成により、細胞毒性を最小限に抑えながら高い抗菌性能を実現する最適なオゾンレベルが提供されることがわかりました。このオゾン治療は、インビトロでシステムによって提供される補助療法とともに使用されました。結果は、オゾンと通常グラム陽性菌にのみ使用される抗生物質でグラム陰性菌を完全に根絶できることを示し、オゾンが他の方法では効果のない抗生物質に対して細菌株を感作させるための補助治療オプションとして有効であることを示しました。さらに、この治療法は生体適合性試験により、ヒト線維芽細胞に対して細胞毒性効果を示さないことが示されています。

医療業界では、皮膚やその他の軟部組織の感染症が患者の罹患率を増加させる原因となっています。褥瘡 (PU) や糖尿病性足潰瘍 (DFU) に感染することが多いこれらの皮膚軟部組織感染症 (SSTI) は、創傷ケアの大規模な世界市場の一部であり、2022 年には 150 億ドル以上に増加すると推定されています。 2024 年までに 220 億ドル1。米国では、SSTI が原因で救急外来受診の 3.5% が入院し、患者は 1 滞在当たり平均 8,000 ドルの費用がかかっています 2,3。糖尿病などの慢性的な健康状態の蔓延と人口の高齢化により、この数は今後数年でさらに増加すると予想されています。米国では、3,420 万人 (人口の約 10%) が糖尿病を患っています4,5。世界規模では、糖尿病成人の約 2% が毎年 DFU を発症し、年間 910 万人の症例が発生し、全 DFU の約半数が感染すると推定されています6、7、8、9。このような感染症は、多くの場合、創傷の治癒の低下や、骨髄炎、全身性感染症、切断のリスクの増加、死亡などの他の症状を引き起こします10、11、12、13。

褥瘡 DFU を含む SSTI 感染症の典型的な治療には、抗生物質の投与が含まれます。この治療法は多くの場合細菌量を減らすことができますが、創傷の早期治癒を促進することには何の役にも立ちません。さらに、抗生物質に対する細菌の耐性は世界的な問題として深刻化しており、現在の治療法の有効性をさらに低下させています14、15、16。グラム陰性菌（G − ve）細菌は、細胞構造に追加の外膜があるため、多くの抗生物質処理に対して自然な耐性を示し、これにより多くの抗生物質が細胞内の目的の標的に到達することが妨げられ、より容易に変化して新たな耐性を発現する可能性があります 17,18 。これにより、多剤耐性 G - ve 細菌の数と重症度が非常に増加したため、世界保健機関 (WHO) は、最も緊急の措置を必要とする抗生物質耐性株のリストに G - ve 細菌のみを含めました 18。多剤耐性 G - ve 病原体の治療に有効な新しい抗菌薬の開発と承認が、細菌の新たな耐性の継続的な出現に追いついていないため、この問題はさらに憂慮すべきことです。これは、医薬品開発のプロセスが長く、費用がかかり、リスクが高く、生産の意欲をそぎ、市場への規制当局の承認という困難な作業を受けているためです19。その結果、SSTI の代替治療選択肢の開発が急務となっています。

この大きなニーズにより、毒性の強い G - ve 細菌株によって引き起こされる感染症に対して使用できる多くの代替療法の研究が行われてきました。最も一般的なのは、冷大気プラズマ (CAP)、金属ナノ粒子 (NP)、およびガス状オゾンの使用です。 CAP を使用した以前の研究では、生成されたイオン化粒子が強力な抗菌特性を示し、創傷の治癒因子の促進にも役立つことが示されています。残念ながら、これらのシステムが機能するには特殊な機器と訓練を受けた人員が必要なため、頻繁な治療にテクノロジーを利用することはできません20,21。銅や銀などの金属 NP も、その強力な抗菌特性により広く研究されています。ナノ粒子ベースの金属は局所創傷治療に幅広い用途が見出されていますが、その主な欠点は自然組織に対する毒性が高いことです 22,23,24。さらに憂慮すべきは、一部の G - ve 細菌株が銀に対する耐性を形成しているという報告です 25。さらに、マイクロニードルパッチやナノファイバーマット用のキトサンなどの新規素材を使用した抗菌パッチも開発されています。これらのパッチは、創傷治癒因子や抗菌物質の送達方法として使用され、創傷の健康を促進します26、27、28、29。このようなシステムやプラットフォームは、より効果的かつより深く治療薬を送達するための新しいルートを提供してきましたが、多くの場合、使用できる薬剤の量が限られているため、慢性創傷に頻繁に適用するのは非現実的です30。さらに、これらのシステムは依然として一般的な抗生物質とナノ粒子を利用していますが、これらはそれぞれ細菌耐性と細胞毒性のため、限られた用途に留まります。一方、ガス状オゾンは、強力で安全かつ利用しやすい代替治療法であることが長年にわたって証明されてきました。研究によると、局所的に適用されたガス状オゾンは、細菌、ウイルス、真菌などを含む広範囲の有害な微生物を除去するのに効果的であることが示されています31。これは、酸化ストレスを加えることで細菌細胞の外膜を弱めるように作用する、もともと強い酸化傾向によるものです 31。抗菌剤としてのオゾンの歴史的な成功により、臨床応用のための幅広い研究が行われてきました。 in vitro 試験の多くは、高濃度のオゾン (0.6 ～ 20 μg/mL) の利用に焦点を当てています。結果は、そのようなレベルでは、オゾンが非常に短い曝露時間でバクテリアを除去できることを示しています32,33。研究されているオゾンのさらなる利点は、細胞の初期の創傷治癒活性を刺激する能力であり、これは酸化ストレスの適用にも関連しています 34,35,36,37,38,39。高濃度治療は感染症をより迅速に治療できますが、特別な機器や設備が必要であり、過度の曝露により健康な組織に損傷を与える可能性があります。しかし、電子システムとパワーフォトシステムの進歩により、小型コロナ放電システムを通じて比較的低濃度のオゾンを生成できるようになりました。このようなシステムは、ポータブル生成アプローチにより、より持続的かつ低レベルのオゾンを標的の創傷部位に提供するという独自の可能性を提供することができ、これにより、特殊な機器や訓練を受けた要員の必要性がなくなり、健康な細胞を損傷するリスクが大幅に軽減されます32,40。

オゾン療法を単独の治療法として使用することに加えて、補助療法としてオゾンを現在の抗生物質と組み合わせると、特に G - ve 細菌の耐性菌に対する効果が大幅に向上することが提案されています。抗生物質の有効性を高める補助療法の使用は、エレクトロポレーション、活性酸素種 (ROS) の化学光合成、オゾンの腹腔内注入などによって以前に研究されてきました 41,42,43。このような併用療法システムにおける抗生物質の有効性の向上は、細菌細胞の外膜を損傷する二次治療を通じて細菌細胞への抗生物質の拡散が増加するプロセスによって説明されています。これらの方法は良好な初期結果を示していますが、エレクトロポレーションの細胞毒性による浸透深さの制限、ROS の光生成に必要な化学合成、オゾン注入の侵襲的手順など、それぞれに重大な制限があります。ウェアラブルパッチを介して局所オゾンを適用すると、細胞膜を酸化し、抗生物質が細胞内に通過するための穴ができるため、同じ相乗効果が得られます44。この技術は、補助療法と抗生物質療法の間で相乗効果を生み出すのに効果的です。このような治療のもう 1 つの利点は、細菌膜の損傷により、利用可能な抗生物質治療の選択肢が増えることです。グラム陽性菌 (G + ve) と G - ve 菌株の主な違いである外膜防御の低下のため、補助的なオゾン療法により、G + ve 菌に一般的に有効な抗生物質を使用できるようになることが期待されます。 G − ve 菌株に効果的に作用します。オゾンを使用して G - ve 細菌の固有または発達した抗生物質耐性を回避すると、現在の抗生物質技術の長期使用が可能になります。また、2 つの併用療法により、抗生物質とオゾンの両方の投与量を減らすことができ、高濃度オゾン曝露による健康への悪影響を制限し、新たな抗生物質耐性の発生速度を遅らせることができます。

ここでは、感染した真皮創傷、特に新規抗菌薬を必要とする薬剤耐性G - ve 細菌によって引き起こされる創傷に対して、局所補助オゾンおよび抗生物質治療を施すための新規統合治療システムの開発について説明します。このシステムは、ポータブルオゾン発生ユニットと創傷表面に接触する使い捨ての貼付パッチの 2 つの部分で構成されています。オゾン発生システムには、オンボードのバッテリーパックとマイクロコントローラーによって制御される低電力オゾン発生器とマイクロブロワーが含まれており、0 ～ 4 mg/h のオゾン供給を制御できます。創傷パッチは、細孔を通る流れを物理的に広げることでより均一なオゾン適用を可能にする内部拡散層、包帯への液体の取り込みを防ぐための疎水性かつガス透過性の膜、および生分解性の膜を含む 3 層構造を特徴としています。抗生物質の局所適用のためのナノファイバー (NF) 薬剤溶出メッシュ 45。これにより、オゾンガスを用いた抗生物質の局所補助療法を可能にする完全に統合されたシステムが構築されます。パッチは創傷部位に直接適用されます。そこでは、生体溶解性ポリマー繊維が創傷床と接触すると分解し、抗生物質のペイロードを創傷に局所的に放出することになる。同時に、図 1 に示すように、ガス状オゾンがポータブル外部オゾン発生システムから、取り付けられたパッチを介して傷の表面にポンプで送り出され、追加の抗菌作用を提供し、細菌の酸化部分による拡散の増加により抗生物質の効果を高めます。膜。

ウェアラブル補助オゾンおよび局所抗生物質治療システム。 (a) オゾンと抗生物質の補助療法は、従来の治療法に反応しない皮膚および軟組織感染症の代替治療法として使用できます。オゾンは抗菌特性を提供し、抗生物質が細胞に侵入してタンパク質生成などの細胞機能を破壊できるようにします。 (b) このシステムは、以下のプロセスで発生中の創傷を治療するためにガス状オゾンとガス透過性および薬物溶出性のナノファイバーマットを利用します: (i) 薬物溶出性ナノファイバーメッシュとガス透過性膜を備えたオールインワン創傷パッチが皮膚に適用されます。傷。 (ii) NF は溶解し始め、局所抗生物質を放出します。 (iii) 局所抗生物質が NF から完全に放出されるため、オゾンは治療期間全体にわたってシステムに適用されます。オゾンと抗生物質は連携して感染を排除します。 (iv) 創傷が治癒したら、創傷パッチをその領域から除去します。オゾンと抗生物質による治療を組み合わせると、抗生物質耐性感染症を治療し、新たな感染症の発症を防ぐことができ、治癒時間を短縮できます。

システムを効果的にするために、次のエンジニアリング基準が考慮されました。まず、システムの可搬性は、患者が臨床機器や動かないテザーに拘束されることなく、長期間治療にアクセスできるようにするために重要です。これにより、患者は自宅で目立たずに、邪魔にならずに簡単に薬を自己投与できます。彼らのライフスタイル。ポータブル電源は、1 台の発電機で 0 ～ 4 mg/h のオゾンを生成するか、2 台の発電機で 0 ～ 8 mg/h のオゾンを生成することができます。最適なオゾン生成速度を特定するために、さまざまな生成速度におけるオゾンの抗菌性と生体適合性の系統的な調査が実施されました。第二に、生理学的に関連する条件における G - ve 細菌の治療の相乗的強化を研究するために、最適化されたオゾンシステムを局所抗生物質と組み合わせてテストしました。これらの治療法は、G + ve 病原体に一般的に使用される抗生物質に対して G - ve 細菌を感作させるためにオゾンを利用することに焦点を当てていました。ガス状オゾンの適用と抗生物質は同時に存在できる必要があるため、クリームなどの抗生物質の一般的な局所投与はオゾンの拡散に対する障壁を作成します。そのため、報告されたシステムは、抗生物質を局所的に送達するために生体溶解性ナノファイバー（NF）のマットを使用します。この研究では、概念実証として使用するために、G + ve 感染症の治療に一般的な 2 つの抗生物質、バンコマイシンとリネゾリドを選択しました。オゾンとこれらの抗生物質を組み合わせると、治療効果が大幅に向上することが研究で示されました。したがって、オゾンが、以前に耐性を示した抗生物質に新たな命を吹き込むための重要な補助治療であると信じる理由があります。さらに、このシステムは、低コストの材料 (使い捨てパッチのコスト: < 2.50 ドル) と臨床現場での導入が容易な局所治療法を使用することにより、臨床試験を経て製品を市場に投入できるように設計されています 37。

オゾン発生および送達システムは、局所オゾンおよび抗生物質による創傷治療を可能にするように設計されました (図 2a)。このシステムは、コロナ放電を使用して周囲の空気からガス状オゾンを生成するオンボードオゾン生成システムと、生成されたオゾンを供給するマイクロブロワーシステムを備えています。オンボードバッテリーは、オゾンとブロワー機能の両方をユーザーが制御するためのスイッチを備えたシステムに電力を供給しました。この設計により、ウェアラブルで再利用可能なシステムからポイントオブケアでのオゾンの生成と適用が可能になり、現在の臨床実践に簡単に組み込むことができます。システムのオゾン生成レベルは、各生成設定でのオゾンの出力を定量化するために特徴付けられました。オゾン発生器の出力はマイクロコントローラーのパルス幅変調 (PWM) 信号によって制御され、流量出力中のオゾン濃度は市販のオゾンセンサーを使用して測定されました。図 2b は、開発されたポータブルオゾン供給システムで 3 つの異なる質量生成設定で 3 回測定されたオゾン濃度の結果を示しています。オゾンレベルは、生成速度が 2 mg/h の場合は 100 ppm、4 mg/h の場合は 132 ppm、8 mg/h の場合は 204 ppm で測定されました。これは、オゾンのベースライン生成オフセットを考慮した場合、オゾン濃度 (ppm) がシステムの質量生成速度に応じてほぼ線形であることを示しています。この制御可能な動作により、オゾン処理用途の最適化された生成速度の調査が可能になります。

ポータブル補助オゾンおよび局所抗生物質治療システム。 (a) 付加的なオゾンおよび抗生物質療法を皮膚創傷に局所的に施すように設計されたオゾン創傷治療システム。このシステムは、オゾン送達用のマイクロブロワーと抗生物質送達用の薬剤溶出 PVA ナノファイバーの多孔質メッシュを備えたポータブルオゾン発生システムで構成されています。ポータブル充電式システムはカスタムハウジングに取り付けられ、オンボードの低電力電子機器を利用します。 (b) ポータブルシステムによって生成されるオゾン濃度と質量発生率との関係。エラーバーは標準偏差を示します。

このシステム用に設計された補助療法パッチは、オゾンの適用範囲を増やす内部分散層、創傷と接触する疎水性包帯、生分解性薬剤溶出NFメッシュの3層で構成されています。内部分散層は、孔径 0.003 ～ 0.02 mm2 (顕微鏡画像から ImageJ で測定) の多孔質ポリマーメッシュから作成され、浸透性包帯を通過して創床に入る前にオゾンガスが全体に拡散できるようにしました。これにより、創傷部位のオゾン被覆範囲とその均一性が大幅に増加することが以前に示されました 37。ガス透過性膜をポリジメチルシロキサン (PDMS) で処理して疎水性を誘導しました。この治療は、治療のための創傷床へのオゾン拡散に悪影響を与えるドレッシング孔への体液の取り込みを防ぎます 37。クリームなどの抗生物質の局所適用の従来の方法ではオゾンの拡散が阻害されるため、生分解性の NF メッシュが使用されました。このメッシュは、エレクトロスピニングプロセスを使用して、ポリ (ビニルアルコール) (PVA) と抗生物質溶液から作成されました。これにより、適用パッチ上に直接、ガス透過性の重複メッシュ構造でナノサイズのポリマーストランドを作成することが可能になりました。

NF の構造と特性を特定するために、エレクトロスピニングプロセスを通じて生成された NF に対して顕微鏡および走査型電子顕微鏡 (SEM) イメージングが実行されました。図 3a ～ h は、光学顕微鏡 (OM) と SEM の両方からのイメージング結果を示しています。 NF の適用および溶解の前後の PDMS 処理ドレッシングの画像比較は、薬物溶出 NF の沈着および溶解によって引き起こされる構造に変化がないことを示しています。この特性は、以下の特性評価でさらに確認され、定量化されました。被覆材上に堆積した NF の画像を見ると、生成されたメッシュの構造は再び多孔質であると結論付けることができます。繊維サイズを測定したところ、バンコマイシンを含む繊維では直径300nm、リネゾリドを含む繊維では直径100nmであった。このサイズの違いは、バンコマイシンのより大きな分子サイズ（リネゾリドの 337.3 Da と比較して 1449.3 Da）によって引き起こされると予想されます 46,47。

エレクトロスピニングされたNFマットの特性。（a、e）オゾンデリバリーパッチ表面の顕微鏡画像、（b、f）NFを含むリネゾリドでコーティングした後、（c、g）NFを含むバンコマイシンでコーティングした後、（d、h）NFの溶解後の顕微鏡画像。画像は光学顕微鏡（a〜d）およびSEM（e〜h）を使用して撮影されました。 (i) バンコマイシンおよびリネゾリド紡糸繊維マット内の孔径の頻度を示すヒストグラム。 (j) 治療のさまざまな段階での包帯の接触角測定。エラーバーは標準偏差を示します。

ImageJ ソフトウェアを使用してさらなる分析を実行しました (図 3i)。両方の抗生物質で作成されたエレクトロスピニングされたメッシュ内の細孔のサイズが測定されました。データはヒストグラムにまとめられました。結果は、各メッシュの細孔サイズにほとんど差がなく、どちらも 0.025 μm2 未満の細孔 (バンコマイシンでは 50.8%、リネゾリドでは 53.5%) が大部分を占めていますが、リネゾリドメッシュには 0.025 μm2 より大きい細孔の割合が大きかったことが示されています。 0.35 μm2 (4.1% 対 1.4%)。これは、繊維の凝集による多孔率が 2 つのメッシュ間で同様であるはずであるが、その変動は堆積したリネゾリド繊維の質量の増加に起因することを示しています。

多孔質包帯の疎水性/親水性も、オゾンの局所適用には重要でした。 NF 層の高レベルの親水性により、流体の相互作用が促進され、迅速な溶解と抗生物質の適用が可能になります。一方、パッチから創傷部位へのオゾンの移動を阻害する被覆材の孔への流体の取り込みを防ぐために、その下の創傷被覆材には高レベルの疎水性が必要である。このため、包帯の疎水性が調査されました。接触角は、NF 堆積前のドレッシングサンプル、NF コーティングを施したドレッシングサンプル、および NF が表面から完全に溶解した後のドレッシングサンプルで測定されました。サンプルの接触角は疎水性に対応します。我々の以前の研究で説明したように、疎水性特性は、繊維上の希釈 PDMS コーティングを通じてドレッシングに注入されました 37。ＰＤＭＳ処理された被覆材の接触角は、ＮＦ堆積前は１３５°であり、ＮＦが表面から完全に溶解した後は１４０＋°であったことが観察された。また、リネゾリドとバンコマイシンを含む両方の NF の接触角がそれぞれ 0° と 82° と非常に低いことがわかります。これらの結果は、NFがパッチ表面から溶解した後でも、人工包帯の疎水性挙動は変化しないことを示しています（図3j）。したがって、パッチの所望の疎水性は治療時間全体を通じて維持され、一方、ＮＦ層によって示される親水性により、流体接触の増加により急速な溶解が可能となる。

治療の全体的なパフォーマンスにとって重要なもう 1 つの特性は、NF 層がある場合とない場合の包帯の多孔性です。これは、包帯の多孔性によってガス状オゾンが浸透し、創傷領域に局所的に影響を与えることができるからです。メッシュの多孔性の影響は、一定の流量がドレッシングを通してポンプで送り出されるときの内部流圧を測定することによって定量化されました。これを特徴付けるために、治療プロセスのさまざまな時点で包帯の状態を変化させました。

図 4a は、5 ～ 25 mL/min の範囲の流量で空気が押し出されたときに測定された内部圧力を示しています。テストされたサンプルには、パッチなし (オープン) のシステムを通過するベースライン流量、疎水性包帯の未処理のサンプル (未処理)、および NF を含む、NF 溶解後の疎水性包帯サンプルが含まれます。リネゾリド繊維が堆積した被覆材を除いて、どのサンプルでも流動抵抗の顕著な増加がないことがわかります。流れに対する抵抗は、最大流量で約 80% 増加しました (図 4b)。この増加は、薬物溶出性 NF の重要な層の追加によるものでした。ＮＦは、パッチ上の層が２０μｇ／ｃｍ２の阻害濃度まで抗生物質を含むように堆積された。バンコマイシンとリネゾリドの溶解度の違いにより、単位質量あたりより多くのバンコマイシンが各繊維にロードされるため、バンコマイシンよりもリネゾリド繊維の層が厚くなりました（バンコマイシン0.1％w/w対リネゾリド0.03％w/w）。バンコマイシン繊維よりも多くのリネゾリド繊維が沈着するため (667 μg/cm2 対バンコマイシンの 100 μg/cm2)、前のセクションで説明した細孔サイズの相対的な類似にもかかわらず、ガス流に対する抵抗に対してはるかに大きな影響がありました。それでも、図 3 に見られる NF の多孔質メッシュ構造により全体的な効果が減少したため、多孔度のレベルが増加してもガスの流れは妨げられませんでした。さらに、繊維の速溶解性 (以下で説明するように)この空隙率の一時的な減少は無視できる程度であると予想されることを意味します。

薬物溶出性NFsコーティングを使用した場合と使用しない場合のオゾンドレッシングの気孔率の特性評価。 (a) 適用のさまざまな段階でのドレッシングのさまざまな流量での内部流動抵抗。 (b) 25 mL/min での内部流動抵抗の比較。エラーバーは標準偏差を示します。

数分から数日までの幅広い設計放出時間による薬物送達における NF の使用を検証する広範な研究があります 48、49、50、51、52、53、54、55、56。 NF の溶解時間の特性評価により、治療のために活性抗生物質が創傷領域に適用される速度と、リネゾリド NF の場合の包帯の多孔性が減少する期間についての洞察が可能になります。この場合、オゾンによって引き起こされる細菌細胞膜の細孔により分子の取り込みが増加するため、抗生物質が細菌細胞と相互作用できるように迅速に放出されることが有益です57,58。溶解時間を特徴付けるために、各抗生物質と同様の分子量を持つ色素を含む NF を、薬物溶出 NF の溶解モデルと同じ条件下でエレクトロスピニングしました。各 NF サンプルを適切なサイズに切断し、指定された期間脱イオン水にさらしました。液体サンプルから吸光度を測定し、完全に溶解したサンプルの測定値と比較しました。次に、このデータを整理して、経時的な溶解パーセンテージを示しました。

溶解速度を完全に特徴付ける前に、繊維の生成に使用された PVA の加水分解が溶解性にどのような影響を与えるかを理解するために研究が行われました。加水分解は、ポリ酢酸ビニルからの合成プロセス中にアセテート基がどの程度除去されるかを示す PVA の特性です 59,60。加水分解の影響は、図 5a に示すようにテストされました。時間が経っても、完全に加水分解されたNFは溶解しませんでしたが、部分的に加水分解された繊維はすぐに溶解しました。これは、完全に加水分解された繊維が 80 °C 以下で溶解しないようにする強力な水素結合相互作用によるものです。したがって、部分加水分解された PVA が速溶性繊維に最適なものとして選択されました。次いで、モデルリネゾリドおよびバンコマイシンＮＦの両方について、ＮＦの溶解を完全に特徴付けた。図 5b に示すように、両方の繊維は高い溶解速度を示しました。モデルのリネゾリド繊維は、おそらくサイズが小さいため、より速く溶解し始めることが見られましたが、モデルのバンコマイシン繊維は、溶解する必要がある繊維の質量がより小さいため、最初に完全な溶解に達しました (7 分)。それでも、リネゾリド繊維は 9 分後に完全に溶解しました。この観察に基づいて、オゾンを適用する前に繊維の完全な溶解と創傷部位への拡散を確実にするために、パッチはオゾン送達を活性化する前に数分間創傷に適用する必要がある。

薬物溶出NFの溶解特性評価。 (a) 部分加水分解および完全加水分解 PVA を使用して製造された NF の溶解速度。 (b) 薬物模倣ダイを注入した部分加水分解された NF の経時的溶解 (赤色はバンコマイシン、青色はリネゾリド)。 (c) 液体およびゲル媒体中のNFの臨界時間10分(合計処理時間の3%未満)までに溶解した材料の割合。 (d) 異なる pH レベルの緩衝液中で青色色素 (リネゾリド) NF が臨界溶解するのに必要な時間の比較。エラーバーは標準偏差を示します。

補助療法の両方の成分が創傷床内で活性である期間を最大化するには、抗生物質の適用に使用される NF が治療期間全体と比較して短期間で溶解できることが重要です。治療に使用されるオゾンと抗生物質の両方が適切に活性化するには、最大 10 分間の合計溶解時間で十分であることが判明しました。 NF は、脱イオン水 (前述のとおり) および疑似半固体創傷環境を模倣する寒天ゲル中でこの基準を満たすかどうかテストされました。図 5c は結果を示しており、模擬創傷ゲル環境においてさえ、NF が所望の 10 分間の時間枠内で完全に溶解したことを示しています。最後に、感染した創傷床で見られる pH は変化する可能性があるため、溶液中のモデルリネゾリド線維の溶解を 3 つの異なる pH 値で特徴付けました。繊維を再度所定のサイズに切断し、pH 6、7、および 8 の緩衝液にさらしました。図 5d は、各 pH で臨界溶解 (> 80%) に達するまでに必要な時間を比較したものです。この結果から、溶液の pH は溶解時間にほとんど影響を及ぼさないことがわかります。

併用療法を評価する前に、ヒト細胞への毒性影響を最小限に抑えながら殺菌特性を最大化するためのオゾン療法の適切な濃度を特定するために、オゾン治療レベルの体系的な研究が実施されました。この試験では、創傷における最も一般的な G - ve 細菌の 2 つである緑膿菌と大腸菌の治療として、3 つの異なるオゾン発生速度、2 mg/h、4 mg/h、および 8 mg/h が試験されました。感染症61．各世代速度の抗菌特性を最良に観察するために、細菌培養物を PBS に懸濁しました。細菌が活発に死滅したり繁殖したりしない恒常性環境を提供するために、これらの実験の試験培地として PBS が選択されました。これにより、さまざまな適用レベルでのオゾン処理の抗菌特性を明確に比較することが可能になりました。図 6 は、両方の菌株において、オゾン生成速度が高いほど予想どおりより速い死滅をもたらし、一方で緑膿菌は全体的にオゾン処理に対する感受性が高いことを示しています。緑膿菌培養物は、オゾン生成速度が 2 mg/h、4 mg/h、および 8 mg/h の場合、それぞれ 5、3、および 2 時間後にテストウェルから除去され、生成速度を 2 mg/h から増やすと有効性がより顕著に増加することが示されました。 4 mg/h から 8 mg/h にさらに増加する場合よりも 4 mg/h に増加します。大腸菌に関する結果もこの傾向を裏付けています。オゾン発生速度 2 mg/h では 8 時間以内に大腸菌培養物の完全な死滅は観察されませんでしたが、4 mg/h では 5 時間後に、8 mg/h では 3 時間後に除去が見られました。

さまざまなレベルのオゾン (2 ～ 8 mg/h) に連続的に曝露された場合の抗菌効果と細胞生存率。 8 時間にわたる PBS 中での (a) 緑膿菌および (b) 大腸菌培養に対する抗菌効果。 (c) 37 °C、2 ～ 8 mg/h のオゾンで 6 時間処理したヒト線維芽細胞の細胞生存率。生存率は、治療終了後 1 日、3 日、および 7 日後に測定されました。 (d) 処理後 1 日および 7 日後に、さまざまなレベルのオゾン療法に曝露されたヒト線維芽細胞の生/死染色。エラーバーは標準偏差を示します。

ヒト線維芽細胞のオゾン生成速度を変えることの影響も調査されました。図 6c は、図 6d に画像化されている、曝露後 1 日、3 日、および 7 日の各生成速度での 6 時間のオゾン曝露後の健康な細胞の割合を示しています。より高いレベルのオゾン、つまり 8 mg/h では細胞にストレスが誘発され、生存率が 50% 減少しますが、2 mg/h と 4 mg/h の両方では毒性の兆候が見られないことがわかります。各条件の抗菌性能と細胞毒性の両方を考慮すると、4 mg/h が細胞毒性を最小限に抑えながら迅速かつ効果的な抗菌特性を提供できることが示されたため、適切なオゾン発生設定として選択されました。

創傷環境は細菌の増殖を促進するため、複製速度が加速され、十分な抗菌特性を得るには高濃度のオゾンが必要になります。これは効果的ではありますが、ヒト細胞に対して細胞毒性の副作用を引き起こす可能性があります。この懸念に対抗するために、有害な副作用を伴うことなく抗菌作用を高めるために、抗生物質と補助オゾン療法の併用効果に関する系統的な研究が報告されています。補助療法の使用によるプラスの効果を示すために、SSTI で一般的に見られる緑膿菌と大腸菌、G - ve 細菌の菌株に対してオゾンと抗生物質による治療をテストしました。これらの検査では、G + ve 細菌の治療に一般的に使用される 2 つの抗生物質、バンコマイシンとリネゾリドが選択されました。通常、G + ve 細菌に対してのみ使用される抗生物質を選択することにより、これらの試験は、耐性のある抗生物質に対して G - ve 細菌を感作する補助療法としてのオゾンの概念実証を実証することができました。さらに、トリプシン大豆ブロス増殖培地および 37 °C で細菌培養物に対して処理を実施しました。細菌の増殖に最適なこれらの条件は、細菌の増殖を促進する自然創傷の環境と同等またはそれを超える環境における補助治療の強度を示すために選択されました。さらに、感染した傷とここで示したシミュレーション条件の両方に存在する細菌の増殖は、抗生物質が細菌に及ぼす影響を完全に確認するために必要です。

図 7 は、補助療法の抗菌特性と生体適合性の結果を示しています。図 7a は、リネゾリドとガス状オゾンの補助療法が抗菌活性の大幅な増加を示したことを示しています。最初の細菌の CFU/mL 測定と比較した場合、陰性対照 (無処理) とリネゾリドおよびバンコマイシンの対照 (抗生物質のみ) の両方で、培地中の健康な細菌が増殖し続けるにつれて個体数が大幅に増加しました。これは、抗生物質自体が予想どおり細菌の増殖をまったく抑制しなかったことを示しています。 4 mg/h のオゾンに 6 時間暴露したオゾンサンプルは、1.52 log10 CFU/mL という適度な細菌減少を示しました。バンコマイシンと併用すると、補助治療により 2.52 log10 CFU/mL の大幅な減少が示されました。さらに、リネゾリドと組み合わせたオゾンは、すべての細菌を完全に除去するというさらに優れた効果を示しました (6.62 log10 CFU/mL)。統計分析により、オゾン療法と併用療法の両方で統計的に有意な結果が得られたことが示されました (p < 0.0001)。どちらの場合も、結果は、オゾンと抗生物質による治療を組み合わせた方が、それぞれを合計した場合よりも効果的であることを示しています。

TSB 培地での細菌培養に対する抗菌効果と、37 °C でのインビトロでの補助オゾンおよび抗生物質療法試験の細胞生存率の結果。 (a) 緑膿菌に対するオゾン + リネゾリドおよびオゾン + バンコマイシン補助療法の結果。 (b) オゾン + リネゾリドおよびオゾン + バンコマイシン補助療法の大腸菌に対する抗菌結果。オゾンを 4 mg/h で 6 時間適用しました。リネゾリドおよびバンコマイシンを200μg/mLの溶液として適用した。 (c) 6時間のオゾン、オゾン+バンコマイシン、およびオゾン+リネゾリド治療に曝露したヒト線維芽細胞の生存率を、治療終了1日後、3日後、および7日後に測定した。 (d) 治療終了後 1 日および 7 日後のヒト線維芽細胞の生/死染色。エラーバーは標準偏差を示します。

同じ試験手順を、皮膚の傷によく見られる別の G-ve 細菌である大腸菌に対しても実行しました。図 7b は、バンコマイシンとリネゾリドの両方の補助療法の結果を示しています。緑膿菌で見られたように、陰性対照および抗生物質対照は、6 時間の処理にわたって細菌の増殖の阻害を示さなかった。オゾン療法単独では細菌数の減少は見られませんでしたが、併用療法では再び有効性の大幅な増加が示され、リネゾリド補助療法により細菌が完全に除去され（6.02 log10 CFU/mL減少）、バンコマイシン補助療法により0.57 log10 CFU/mLの減少が可能になりました。 mLの減少。リネゾリドとバンコマイシンの性能の違いは、2 つの異なる分子と作用機序によって説明できます。バンコマイシンは細胞壁のペプチド層に結合することで機能することが知られており、これにより架橋が阻害され、分裂中に細胞溶解が引き起こされます。バンコマイシンは大きな分子 (1449.3 Da) であるため、G - ve 細菌では外側に追加の脂質層が存在するため、一般にペプチド層へのアクセスが禁止されています 62,63。オゾンは、一部のバンコマイシン分子が酸化的破壊によってこの保護層を回避できるようにするという仮説が立てられていますが、その効率は完全な強度の作用には十分ではありません。一方、リネゾリドははるかに小さい分子 (337.3 Da) で、タンパク質生産に必要な RNA 鎖に結合することで細菌の繁殖を阻害します 64,65。リネゾリドはサイズが小さいため、オゾンによって作られた酸化穴を通って細菌細胞に容易にアクセスできます。さらに、オゾンとリネゾリドによって適用される 2 つの異なる作用メカニズムの組み合わせにより、同じ適用条件下で細菌を死滅させる際により高い効率を示すことができます。これらの結果は、通常 G + ve 株にのみ使用される抗生物質に対して G - ve 細菌を感作させるための補助療法としてガス状オゾンを使用する利点を裏付けています。これは、オゾンによって引き起こされる酸化反応により、以前は本質的にその影響を受けなかった細菌に対して新しい抗生物質分子が機能できることを示す概念実証であるため、非常に重要です。この組み合わせアプローチは、有効な抗生物質の数を増やし、発生した耐性を回避する可能性があるため、効果がなくなった抗生物質を再利用する手段を提供できます。

最後に、オゾンの適用が抗生物質の機能に悪影響を及ぼさないことを確認するために、2 つのテストが実施されました。まず、8 時間のオゾン曝露の前後で両方の抗生物質サンプルのフーリエ変換赤外 (FTIR) 測定値を取得しましたが、分子構造に変化は見られませんでした。第二に、バンコマイシンとリネゾリドを使用した、G + ve 細菌に対する 8 時間のオゾン曝露前後の抗菌試験でも、4 mg/h での長時間のオゾン曝露による効果の変化は見られません。これら 2 つのテストは、パッチを通して送達されたガス状オゾンが抗生物質化合物に悪影響を引き起こさないことをさらに検証します。詳細については、サポート情報を参照してください。

ヒト線維芽細胞を 4 mg/h で生成されるオゾンガスに長期間 (6 時間) 曝露しても、細胞にストレスや生存率の低下の兆候が見られないことが以前に示されています。ここでは、これらのレベルでガス状オゾンとしての局所抗生物質の併用療法の安全性を評価し、併用療法によって細胞毒性化合物が生成されないことを検証することも重要でした。生体適合性を研究することで、この治療システムが効果的であり、安全に使用できることを示すことができました。これを検証するために、ヒト線維芽細胞の全身生体適合性試験が実施されました。この試験では、細胞をオゾン療法（抗生物質の有無にかかわらず）に曝露するか、対照として放置しました。それぞれの場合において、細胞サンプルは、リネゾリド、バンコマイシンのいずれかを含む、または抗生物質を含まない試験阻害濃度の溶液に曝露されました。テストは、抗菌研究と同じ 6 時間および 4 mg/h のオゾンパラメーターの下で実施されました。図 7c は、抗生物質溶出電界紡糸ナノファイバーと組み合わせて抗生物質で処理した線維芽細胞の生存率 (対照群に対して正規化) を評価するために実行された in vitro MTT アッセイおよび生死染色 (図 7d) の結果を示しています。。オゾン、オゾン + バンコマイシン、オゾン + リネゾリドで処理した細胞の生存率は、1 日後にはそれぞれ 98.6%、99%、98.2%、7 日後にはそれぞれ 98.8%、98.5%、97.2% でした。これらの結果は、併用治療アプローチが線維芽細胞の生存率に悪影響を及ぼさなかったことを示しています。

この研究において、我々は、G - ve 細菌の耐性株を標的とした補助オゾンと抗生物質療法の統合適用のためのポータブル装置を初めて提示する。抗生物質とガス状オゾンの両方に対する新しい複合送達システムは、抗生物質を含む急速溶解 PVA ナノファイバーの使用によって実現されます。 NF マットの開発、構造、浸透性は補助治療に非常に役立つことがわかりました。システムによって適用されるオゾンレベルの最適化は、ヒト細胞に対する細胞毒性を最小限に抑えながら、高い抗菌効果を持つ治療を実現するために実行されました。最後に、オゾンと、G+ve 細菌に対して一般的に有効な 2 つの抗生物質、バンコマイシンおよびリネゾリドとの間の補助療法の有効性を検証するために広範な研究が実施されました。この組み合わせは、細胞毒性の兆候を示さずに、インビトロでグラム陰性細菌である緑膿菌および大腸菌の治療を大幅に増加させることが示されました。このシステムは、感染した皮膚創傷の効果的な治療法となることが大いに期待されており、抗生物質耐性感染症の有病率が上昇し続ける中、臨床医と患者が利用できる治療選択肢の数を大幅に増やすことができます。この分野でのさらなる体系的な生体内研究は、臨床試験や人間への使用に向けて技術が開発されるにつれて、必要な検証を提供するでしょう。このプラットフォームは、オゾン併用療法を使用して以前の抗生物質を再び効果的にする新たな機会を提供する可能性があります。これは、慢性創傷の危機の解決と耐性感染症の治療に向けた重要な一歩です。

創傷被覆材とパッチは、以前の研究で概説したのと同じプロセスを使用して製造されました37。簡単に説明すると、PDMS (Sylgard 184) の混合物をヘプタンで 1:5 w/w に希釈し、包帯の作成に使用されるレーヨン - スパンデックス生地 (84.5 mm × 67 mm) をコーティングして疎水性を誘導しました。乾燥後、オゾンの影響を受ける領域を増やすために使用される内部分散層を間に挟んで、これをPDMSバッキングに接着します。このシステムは、3 M 300LSE 両面接着ストリップを使用して接着されました。生分解性薬物放出 NF は、ポリビニルアルコール (PVA) (実証済みの生体適合性と水への高い溶解度により選択) および水溶液 (10% w/w PVA) から紡糸されました。抗生物質は、塩酸バンコマイシン (1404-93-9 Chemimpex) とリネゾリド (165800-03-3 Chemimpex) の両方に対して 1% w/w で添加されました。 NF メッシュを生成するために、ドレッシングをエレクトロスピニング機 (Tong Li Tech TL-Pro-BM) のドラムに付着させました。ファイバーは、10% w/w PVA 水溶液 (P1763 完全に使用) を使用して、20 kV および -2 kV の電位、およびチップからコレクタまでの距離 14 cm の流速 0.65 mL/min の 18 g チップを使用して針から紡糸されました。加水分解 PVA または 843,869 部分加水分解 PVA (MW = 70,000)、Sigma-Aldrich)。抗生物質濃度が 200 µg/cm2 になるように、回転ドラム (直径 10 cm、30 RPM) に固定された基板上に繊維を堆積させました。

生成されたメッシュの構造、サイズ、細孔を特定するために、繊維のイメージングが行われました。光学イメージングは Steindorff OM を使用して実行されました。 SEM 画像は、サンプルを Au-Pd で 36 nm までスパッタリングした後、Hitachi S-4800 フィールドエミッション SEM を使用して 4 kV、20 mA で撮影しました。画像処理により、キャプチャされた画像内の繊維および細孔サイズの測定が可能になり、測定および粒子分析ツールを備えた ImageJ ソフトウェアを使用して行われました。

サンプルの疎水性を定量化するために使用される接触角測定は、Rame-Hart Model 290 F1 Advanced Goniometer を使用して 3 回測定されました。空気流の圧力測定は、Omega DPG 4000 圧力センサーを使用して 3 回取得され、空気流は New Era 1000 シリンジポンプで生成されました。各サンプルに一定の流れを加え、同時に圧力を読み取って、サンプルを通る流れに対する抵抗による内部圧力の上昇を測定しました。

PVA NF の溶解を測定するために、前述のように、Tong Li エレクトロスピニングドラムに取り付けられたアルミニウム箔基板上に NF をエレクトロスピニングしました。分光光度分析用に抗生物質の代わりに可視色素をロードした NF を生成するために、各薬物に関連する水溶解度レベルで色素を PVA に添加しました (0.1% ダイレクトレッド 80 [Sigma Aldrich 365548] および 0.03% メセリンブルー (Sigma Aldrich M9140))。２０μｇ／ｃｍ２の質量が得られるまで回転させた。どちらの色素も、抗生物質の分子サイズを模倣するように選択されました (補足図 1)。他のすべての堆積特性は同じに保たれました。 40 W ファイバーレーザー (1.06 μm) を備えた PLS6MW レーザーカッターを使用して、サンプルを所定のサイズに切断しました。溶解速度を特徴付けるために、0.3 cm2 のサンプルを 96 ウェルプレートに置き、300 μL の脱イオン水に曝露しました。 1 セットのサンプルは 1 分後に除去され、次の各サンプルはさらに 2 分後に除去されました。次いで、溶液を振盪して均質化し、100μLのサンプルをピペットで別の96ウェルプレートに移し、BMG ClarioSTAR PLUS分光光度計で吸光度を測定した。同様の手順を、pH 変動実験でも再現し、DI 水の代わりに pH 値 6、7、および 8 の透明な緩衝液 (Sigma-Aldrich) を使用し、また P1763 を使用した加水分解度の影響を研究しました。完全加水分解 PVA または 843,869 部分加水分解 PVA (MW = 70,000)。各サンプルを 3 回測定しました。

創傷床の状態を模倣するために使用されるゲル溶解試験は、水に 0.5% w/w まで溶解された低融点アガロースゲル (Sigma-Aldrich) を使用して実施されました。次いで、アガロースを１ｍＬのサンプルとして１２ウェルプレートにピペットで移し、静置した。アルミニウム箔基板上の青色（リネゾリド）NF の 1 cm2 円を、PLS6MW レーザーカッターを使用して所定の形状に切断し、ゲル表面上に配置しました。最初のサンプルセットは 1 分後に除去され、その後、次の各サンプルはさらに 2 分後に除去されました。次に、溶解した繊維を含むゲルサンプルを加熱により溶解し、撹拌した後、100 μL のサンプルを抽出し、BMG ClarioSTAR を使用した光学読み取り用の 96 ウェルプレートにピペットで移しました。各サンプルを 3 回測定しました。

SSTI で見られる 2 つの一般的な G - ve 病原体である緑膿菌 (25668) および大腸菌 (25922) の臨床分離株は、American Type Culture Collection (ATCC) から入手しました。すべての培地と抗生物質は Sigma Aldrich (セントルイス、ミズーリ州) から購入しました。細菌培養物を、トリプシン大豆ブロス（TSB、Sigma Aldrich、セントルイス、ミズーリ州）の溶液中で凍結ストックから復活させ、一晩インキュベートした。復活したストックからのサンプルをリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 1:50 に希釈し、約 107 CFU/mL の開始接種量を達成しました。各測定点から 3 つの新しいウェルを取り出せるように、50 μL のサンプルを 96 ウェルプレートにピペットで移しました。このようなプレートを 3 枚用意し、それぞれ 1 枚を疎水性膜層、内部分散層、および PDMS 裏打ちからなる前述のガス透過性包帯を通して 2 mg/h、4 mg/h、および 8 mg/h のオゾン療法に曝露しました。。オゾンガスを室温で８時間連続的に適用した。 1 時間ごとに 20 μL のサンプルを 3 つのウェルから採取し、TSB 寒天プレート上にプレーティングするために段階的に希釈しました。

生体適合性実験は、Kasi らによって以前に使用された手順を採用しました 66。オゾン処理の細胞適合性は、NIH/3T3 線維芽細胞 (ATCC から購入) を用いて、酵素駆動比色アッセイ、CellTiter 96 Aqueous One (Promega) によって分析されました。酵素は ATP を使用して酵素機能を駆動するため、生細胞のみが基質を分光光度計で検出可能な化合物に変換します。プレートを、10% FBSを含むDMEM培地中でNIH/3T3細胞とともに培養した。細胞適合性をテストするために、0 日目にパッドを介してオゾン (2 ～ 8 mg/h) を細胞に曝露します。各ウェルには 5000 細胞/mL の懸濁液がありました。 3 枚のプレートを使用して、各濃度の細胞生存率を研究しました。各プレートで 3 つのウェルを複製して使用しました。細胞培養チャンバー (CO2 チャンバー、37 °C) 内で、さまざまなオゾン濃度に 6 時間暴露しました。オゾン処理を行わなかった細胞も対照として使用した。 DMEM 懸濁液を毎日テストウェルから吸引し、200 μL の MTT 試薬で覆いました。試薬と培地の比率は 20:100 µL で、合計 200 µL でサンプルをカバーしました。 NIH/3T3 細胞が付着したサンプルは、1 時間基質を還元させました。次に、100 μL の 3 つのアリコートを 96 ウェルプレートに移しました。サンプルの吸光度は、ブランク MTT 試薬で校正された分光光度計 SpectraMax M2 (MolecularDevices、USA) で 490 nm の固定波長で読み取られました。異なるオゾン曝露時の細胞生存率を研究するために、生/死イメージングも行われました。 MTT アッセイで前述したのと同じセットアップを使用して、視覚的な細胞生存率を研究しました。 NIH/3T3 線維芽細胞が増殖しました。カルセイン AM とエチジウムホモダイマー - 1 を使用して、1 日目、3 日目、7 日目などの異なる時間間隔で細胞の生死を画像化しました。NIH/3T3 細胞は、MTT 分析で前述したように増殖させ、3 つの同一のプレートを使用しました。対照（無処理）を研究に使用した。細胞は、NIS-Elements D ソフトウェアを使用して 10X 光学レンズの下にカメラを備えた Nikon Ti2 Eclipse のそれぞれのフィルターを使用して画像化されます。

抗生物質と組み合わせたオゾンの抗菌効果をテストするために、同じ ATCC 25668 緑膿菌および ATCC 25922 大腸菌培養物をトリプシン大豆ブロス (TSB、シグマアルドリッチ、ミズーリ州セントルイス) の溶液に接種し、一晩インキュベートしました。。成熟培養物のサンプルを新しい TSB で 1:500 (開始接種量約 106) に希釈し、創傷環境をよりよく再現するためにテスト中の継続的な細菌の増殖に必要な栄養素を提供しました。次いで、新しい培地を、２０００μｇ／ｍＬの脱イオン水中のリネゾリドまたはバンコマイシン溶液とともに１：１０で３つずつ試験ウェルにピペットで移した。各ウェルの最終溶液の容量は 50 μL、抗生物質の濃度は 200 μg/mL でした。

細菌サンプルを、4 mg/h オゾンと 200 μg/mL のバンコマイシンおよび 200 μg/mL のリネゾリドの組み合わせ処理に供しました。この抗生物質の濃度は、通常耐性の細菌株の治療に十分な抗生物質強度を可能にする高濃度 (10 倍) となるように選択されました 41、67、68、69、70。テスト中、適切な細菌の増殖が可能であることを確認するために、テストサンプルは 37 °C に保たれました。２時間、４時間、および６時間の時点で、指定されたウェルのセットから２０μＬのサンプルを採取し、ＴＳＢ寒天プレート上にプレーティングした。 37℃で一晩インキュベートした後、細菌コロニーをカウントしました。実験的な補助療法サンプルを、オゾンのみの処理と、オゾンを使用せずに抗生物質に曝露した対照培養物と比較しました。

補助療法の生体適合性実験は、オゾン療法について上で概説した手順に従って行われました66。つまり、オゾン補助治療は、ATCC から購入した NIH/3T3 線維芽細胞を用いて、同じ比色アッセイを使用して分析されました。 5000 細胞/mL の細胞を含む培養プレートを 0 日目に 4 mg/h オゾンおよび 200 μg/mL バンコマイシンまたは 200 μg/mL リネゾリドでテストし、無処理の細胞と比較しました。組み合わせ処理は、37 °C の細胞培養チャンバー内で 6 時間暴露されました。 MTT アッセイを各サンプルに 20:100 μL で添加し、1 時間基質を還元させました。分光光度計を使用して 490 nm で吸光度を測定するために、3 つの 100 µL サンプルを 96 ウェルプレートに移しました。さらに、1、3、7 日後にサンプルを生死イメージングにさらし、対照結果と比較しました。染色画像は 10 倍の光学レンズを使用して撮影されました。

一元配置分散分析テストを使用して、抗菌テストのサンプルの統計的有意性 (α = 0.05) を決定しました。その後、多重比較のためのダネット検定を実行して、異なる条件および時点間の統計的差異を検証しました。

現在の研究中に生成されたデータセット、および/または現在の研究中に分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、プロジェクト全体を通して支援してくれたパデュー大学バークナノテクノロジーセンターのスタッフ、およびパデュー機械工学部およびパデュー材料工学部に感謝したいと思います。

米国ウェストラファイエットのパデュー大学機械工学科

アレクサンダー・ロス

Birck Nanotechnology Center、ウェストラファイエット、米国

アレクサンダー・ロス、シナ・ネジャティ、アクシャイ・クリシュナクマール、ヴィディヤ・セルヴァマニ、ソトゥーデ・セダガート、ラヒム・ラヒミ

ノースカロライナ大学チャペルヒル校、エシェルマン薬科大学院、薬剤工学および分子薬学部門、米国チャペルヒル

ムラリ・カンナン・マルサムトゥ & ジュリアン・グエン

米国ウェストラファイエットのパデュー大学材料工学科

シナネジャティ、ヴィディヤセルヴァマニ、ソトゥーデセダガート、ラヒムラヒミ

パデュー大学、電気およびコンピュータ工学科、ウェストラファイエット、米国

アクシャイ・クリシュナクマール

米国ブラックスバーグ、バージニア工科大学生物医学病理生物学部

モハメド・N・セリーム

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AR は製造、特性評価、抗菌テストを実行しました。 SN と AK は抗菌テストを支援しました。 SS は SEM イメージングを実行しました。 VS と MKM は生体適合性手順に貢献しました。 JN と MS は微生物学的指導とフィードバックを提供しました。 RR はエンジニアリングの監督と指導を提供しました。

ラヒム・ラヒミへの通信。

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転載と許可

Roth、A.、Maruthamthu、MK、Nejati、S. 他。グラム陰性皮膚細菌感染症の治療のためのウェアラブル補助オゾンおよび抗生物質治療システム。 Sci Rep 12、13927 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-17495-3

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受信日: 2022 年 3 月 25 日

受理日: 2022 年 7 月 26 日

公開日: 2022 年 8 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17495-3

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